Вирусологический метод, основные этапы. Вирусологические исследования Серологические методы диагностики, применяемые в вирусологии

Вирусы в отличие от бактерий размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вирусов может осуществляться на уровне организма подопытного животного (куриный эмбрион как развивающийся организм относят к подопытным животным) или живой клетки, выращиваемой вне организма, т.е. на уровне культуры клеток.

Использование лабораторных животных. Один из методов выделения и культивирования вирусов - заражение лабораторных животных. Их используют для выделения вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах. Применение лабораторных животных позволяет также по клиническому симптомокомплексу идентифицировать характер вирусной инфекции. В качестве лабораторных животных, в зависимости от целей работ и вида исследуемых вирусов, чаще всего применяют белых мышей, хомяков, морских свинок, кроликов. Из более крупных животных используют обезьян различных видов и некоторых других животных. Из птиц используют кур, гусей, уток. В последние годы чаще применяют новорожденных животных (более чувствительных к вирусам), «стерильных животных» (извлекают из матки и содержат в стерильных условиях с использованием стерильного воздуха и стерилизованного корма) и животных чистых линий с известной наследственностью (инбредные или линейные животные).

В эксперимент берут только здоровых животных, лучше из одного питомника и одной партии. Температуру тела измеряют в одно и то же время, так как имеются суточные колебания ее. Исследуемый материал вводят с учетом тропизма вирусов к определенным тканям. Так, для выделения нейтротропных вирусов материал вводят в мозг, для выделения пневмотропных - через нос (под легким эфирным наркозом).

У лабораторных животных после заражения вируссодержащим материалом важно своевременно и правильно взять материал для дальнейшего исследования, причем асептически. Результаты выделения вируса считают положительными, если у животного после соответствующего инкубационного периода развиваются симптомы инфекции.

Использование куриных эмбрионов. В тканях эмбриона, его оболочках, желточном мешке способны размножаться многие патогенные вирусы человека и животных. При этом имеет значение избирательность вирусов к той или иной ткани: вирусы группы оспы хорошо репродуцируются и накапливаются в клетках хорион-аллантоисной оболочки, вирус паротита - в амнионе, вирусы гриппа - в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства - в желточном мешке.

Культивирование вирусов в развивающихся эмбрионах имеет ряд преимуществ перед другими методами: плотная скорлупа довольно надежно защищает внутреннее содержимое от микробов; при заражении куриных эмбрионов получают больший, чем при других методах культивирования, выход вируссодержащего материала; метод заражения куриных эмбрионов прост и доступен любым вирусологическим лабораториям; эмбрионы обладают достаточной жизнеспособностью и устойчивостью к возбудителям внешних факторов. Однако куриные эмбрионы не всегда свободны от латентных вирусных и бактериальных инфекций. Трудно наблюдать за динамикой патологических изменений, происходящих в эмбрионе после заражения его вирусом. При вскрытии зараженных эмбрионов часто не обнаруживают видимых изменений и выявляют вирус с помощью реакции гемагглю- тинации и другими методами. В зараженных эмбрионах невозможно проследить за нарастанием титра антител. Метод пригоден не для всех вирусов.

Для вирусологических исследований используют эмбрионы 7-12-дневного возраста, которые получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обычном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37 °С, а влажность воздуха - 60-65%. Отбирают крупные, чистые (но немытые), оплодотворенные яйца от белых кур, хранившиеся не более 10 суток при температуре 5-10°С. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка.

При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения эмбрионов, но наибольшее практическое применение получили нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость и желточный мешок

(рис. 10.5). Выбор метода зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Рис. 10.5.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона на овоскопе. Живые эмбрионы подвижны, хорошо видна пульсация сосудов оболочек. При овоскопировании отмечают простым карандашом на скорлупе границы воздушного мешка или место расположения эмбриона, которое определяют по его тени на скорлупе.

Куриные эмбрионы заражают в боксе в строго асептических условиях, используя инструменты, стерилизованные кипячением.

При заражении на хорион-аллантоисную оболочку наиболее пригодны 12-дневные эмбрионы. Для заражения в аллантоисную полость используют эмбрионы 10-11-дневного возраста, в амниотическую полость - эмбрионы 7-11-дневного возраста, в желточный мешок - эмбрионы 7-дневного возраста.

Яйца с зараженными эмбрионами устанавливают на подставках тупым концом вверх. Температурный режим и срок инкубации зависят от биологических свойств инокулированного вируса. Ежедневно жизнеспособность эмбрионов контролируют под овоскопом. Эмбрионы, погибшие в первые сутки после заражения вследствие травмы, не исследуют.

Перед сбором материала эмбрионы охлаждают при 4 °С в течение 18-20 ч для сужения сосудов и предотвращения кровотечения при вскрытии. Эмбрионы вскрывают в боксе с соблюдением правил асептики.

Аллантоисную жидкость насасывают пипеткой, контролируют стерильность путем посева в сахарный или мясо-пептонный бульон, проверяют на наличие вируса в реакции гемагглютинапии и хранят при 4 °С в замороженном состоянии.

Для получения амниотической жидкости вначале отсасывают аллантоисную жидкость, затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку, слегка приподнимают ее и пастеровской пипеткой отсасывают амниотическую жидкость.

При изучении изменений на хорион-аллантоисной оболочке ее разрезают ножницами и через отверстие выливают все содержимое в чашку Петри. Хорион-аллантоисная оболочка остается внутри скорлупы и ее извлекают пинцетом в чашку Петри с физиологическим раствором. Здесь ее промывают, расправляют и изучают на темном фоне характер очаговых поражений.

Для получения амниотической оболочки амниотический мешок, в который заключен эмбрион, разрезают и освобождают от эмбриона, просматривают на наличие поражений.

Для получения желточной оболочки разрезают хорион-аллантоис, отсасывают аллантоисную и амниотическую жидкости, извлекают пинцетом плод, отделяют его за пупочный канатик, захватывают желточный мешок и помещают в чашку Петри. Контролируют на стерильность, просматривают на наличие поражений. Желток в случае необходимости его извлечения можно отсосать шприцем без выведения наружу желточного мешка.

Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкостях зараженного эмбриона определяют в реакции гемагглютинации. Жидкости эмбрионов с положительным результатом гемагглютинации после проверки на стерильность соединяют и титруют в развернутой реакции гемагглютинации.

При наличии небольшого количества вируса или невозможности выявить его в исследуемом материале проводят последовательные пассажи на куриных эмбрионах. Если после трех последующих пассажей на эмбрионах в исследуемом материале вирус не обнаруживают, результат считают отрицательным.

Использование культур клеток. Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе, так как используемые питательные среды служат отличным питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых пробок, применяемых при культивировании клеток.

Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество дистиллированной воды (проверяется два раза в неделю). Для работы с клетками используют бидистил- лированную или деионизированную воду. Лучшими дистилляторами являются приборы из стекла или легированной стали: из такой аппаратуры не вымываются ионы тяжелых металлов, являющихся токсичными для клеток. Деонизированную воду получают на специальных установках, где очистка воды от солей осуществляется при ее последовательном прохождении через колонки с анионитом и катионитом.

При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют к подготовке и стерилизации посуды и пробок. Во многих случаях именно неправильные их мойка и стерилизация служат причиной не прикрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим сложный комплекс физико-химических факторов: определенная температура, концентрация водородных ионов, неорганические соединения, углеводы, аминокислоты, белки, витамины, кислород и углекислота, поэтому для культивирования вирусов в культурах клеток используют сложные по составу питательные среды. По характеру компонентов, входящих в их состав, эти среды делят на две группы.

• 1. Среды, представляющие собой смеси солевых растворов (Хенк- са, Эрла и др.) и естественных компонентов (сыворотка крови животных и человека, гидролизат альбумина). Количество каждого из этих компонентов в разных прописях сред различно.
• 2. Синтетические и полусинтетические среды, состоящие из солевых растворов (Эрла, Хенкса идр.) с добавлением аминокислот, витаминов, коэнзимов и нуклеотидов (среды Игла, 199 идр.). В синтетических средах клетки могут существовать в жизнеспособном состоянии непродолжительное время (до 7 дней). Для более длительного поддержания их в жизнеспособном состоянии, а также для создания лучших условий роста и размножения клеток к синтетическим средам добавляют сыворотку крови животных (коров, телят и др.).

Для выделения вирусов могут быть использованы разные методы культивирования клеток вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах-матрацах вместимостью 1 л, 250 и 100 мл или в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом.

При использовании первично-трипсинизированных культур клеток сущность метода заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания монослоя на поверхности стекла. Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов человека и животных, забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции. Используют нормальные и злокачественные перерожденные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных.

Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, значит, посуда плохо обработана или токсичны ингредиенты питательной среды.

Наряду с первично-трипсинизированными тканями для культивирования вирусов широко используют культуры перевиваемых клеток, т.е. культуры клеток, способных к размножению вне организма неопределенно длительное время. Наиболее часто применяют культуры клеток, полученные из нормальных и раковых тканей человека. Широкую известность приобрела линия клеток HeLa, полученная из опухоли шейки матки, Нер-2 - из карциономы гортани, КВ - из ткани рака полости рта. Готовят такие культуры клеток и из нормальных тканей животных - почки обезьяны, кролика и эмбриона свиньи (табл. 10.1).

Для пересева перевиваемых клеток питательную среду отсасывают пипеткой и выливают. Сформировавшийся тонкий слой клеток разрушают раствором трипсина, и освобожденные таким образом клетки переносят в новый сосуд со свежим питательным раствором, где вновь образуется монослой клеток.

Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток могут служить:

• а) развитие специфической дегенерации клеток;
• б) обнаружение внутриклеточных включений;
• в) обнаружение специфического антигена методом иммунофлюоресценции;
• г) положительная реакция гемадсорбции;
• д) положительная реакция гемагглютинации;
• е) образование бляшек.

Таблица 10.1

Перечень наиболее употребляемых культур перевиваемых клеток

Для выявления специфической дегенерации в зараженных культурах клетки ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию, т.е. оказывают цитопатогенное действие (ЦПД) (рис. 10.6).

Рис. 10.6.

Время развития и характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяются свойствами и дозой ино- кулированного вируса, а также свойствами и условиями культивирования клеток. Одни вирусы вызывают ЦПД в пределах первой недели после заражения (вирусы оспы, полиомиелита, Коксаки В и др.), другие - спустя 1-2 нед. после заражения (аденовирусы, парагриппоз- ные вирусы, ECHO и др.).

Вирусы вызывают цитопатические изменения трех основных типов: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов, являющихся результатом слияния цитоплазмы многих клеток; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток.

При размножении некоторых вирусов в культурах клеток образуются внутриклеточные включения в цитоплазме или ядре пораженных клеток. Культуры клеток для выявления включений выращивают на стеклянных пластинках в пробирках, заражают вирусом и через определенные сроки инкубации готовят препараты, окрашивая их обычными красителями.

Для выявления специфического антигена в зараженных культурах клеток препараты готовят так же, как для выявления включений, используя МФА.

В основе метода бляшек лежит образование в монослое зараженных вирусом клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных (погибших) клеток. Эти участки, получившие называние бляшек, представляют собой колонии вируса, образующиеся, как правило, из одной вирусной частицы.

При отсутствии цитопатических изменений, внутриклеточных включений, бляшкообразования, отрицательных реакций гемадсорб- ции и гемагглютинации в культурах клеток, зараженных исследуемым материалом, проводят два последующих пассажа. При отсутствии указанных изменений в конечном пассаже результат выделения вируса считают отрицательным.

Для обнаружения вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы.

Микроскопические:

• а) вирусоскопия;
• б) обнаружение внутриклеточных включений.

Иммунологические:

• а) иммунная электронная микроскопия;
• б) иммунофлюоресценция;
• в) гемагглютинация;
• г) гемадсорбция.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью иммунологических методов, включающих следующие реакции:

• а) торможения гемагглютинации;
• б) задержки гемадсорбции;
• в) связывания комплемента;
• г) нейтрализации;
• д) преципитации в геле агара.

Микроскопические методы. С помощью светового микроскопа могут быть обнаружены только крупные вирусы, размеры которых превышают 150 нм. Распознавание вирусов, имеющих меньшие размеры, возможно лишь в электронном микроскопе. Для выявления крупных вирусов может применяться световая, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия.

При вирусных инфекциях в зараженных клетках развиваются своеобразные включения. Одни инфекции сопровождаются образованием включений в цитоплазме пораженных клеток (бешенство, оспенная вакцина), другие - в цитоплазме и ядре (корь, натуральная и ветряная оспа, аденовирусные заболевания). Включения имеют различную природу, структуру, форму и размеры от 0,25 до 25 мкм. Согласно современным данным, при одних инфекциях включения являются местом размножения вируса и представляют собой его скопления, окруженные веществами клетки, при других - продукт дегенерации клетки.

Включения могут быть выявлены в окрашенных отпечатках органов и тканей, соскобах клеток, гистологических срезах из пораженной ткани и препаратах культур клеток, инфицированных вирусом. Окраску чаще производят по методу Романовского - Гимзы. Для окраски этим методом препараты фиксируют в смеси Дюбоска - Брази- ля - Буэна, состоящей из пикриновой кислоты, формалина, спирта, уксусной кислоты. Внутриклеточные включения при большинстве вирусных инфекций являются оксифильными и красятся по методу Романовского - Гимзы в розовый или сиреневый цвет.

Иммунологические методы диагностики вирусных инфекций. В последние годы эти методы стали ведущими в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Это во многом объясняется экономическими причинами, поскольку классические методы вирусологического анализа довольно дороги. Кроме того длительность исследований с помощью вирусологических методов (недели), даже если они оказываются вполне эффективными, делают их ретроспективными.

Иммунологические методы используют как для обнаружения вирусных антигенов в различных биосубстратах и объектах внешней среды, так и для серодиагностики - выявления в сыворотках крови больных людей и лабораторных животных антител к вирусным антигенам. Помимо этого иммунологические методы исследования незаменимы при идентификации вирионов.

Взаимодействуя с организмом, вирусы вызывают образование антител, которые, адсорбируясь на вирионах, препятствуют проникновению вирионов в клетки и развитию цитопатического действия (ЦПД); нейтрализуют смертельное действие вирусов при репродукции их в куриных эмбрионах и организме животных; инактивируют вири- онные гемагглютинины и нейраминидазы, предотвращая реакцию ге- магглютинации (РГА) и реакцию гемадсорбции (РГадс) на пораженных вирусом клетках. Эти вируснейтрализуюшие антитела вызывают также агглютинацию и преципитацию вирусных частиц, а образующиеся при этом иммунные комплексы связывают комплемент. Поэтому для идентификации вирионов используются классическая реакция нейтрализации (PH) на культурах клеток, куриных эмбрионах и животных и ее модификации: реакция торможения гемагглютинации (РТГА); реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Те же реакции используются в серодиагностике вирусных инфекций для обнаружения в сыворотке больных вируснейтрализующих антител по известному вирусному антигену (диагностикуму).

Метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Электронная микроскопия в настоящее время играет важную роль в изучении вирусов. Именно данные электронной микроскопии служат основой современной классификации вирусов.

Новый этап в развитии электронно-микроскопического изучения вирусов - применение техники иммуноэлектронной микроскопии. С помощью этого метода стали возможными не только прямое обнаружение вирусов, но и их идентификация, а также быстрое сероти- пирование вирусных штаммов и титрование антител к ним. Большое значение ИЭМ приобрела для определения локализации вирусных антигенов внутри клеток макроорганизма.

Несомненным преимуществом ИЭМ является ее высокая чувствительность по сравнению с обычными электронно-микроскопическими методами.

При контакте антигена вируса или вирусного компонента с гомологичной антисывороткой формируется комплекс антитело - антиген. Данный феномен является основой методики, употребляемой для обнаружения и идентификации вирусных антигенов или антител к ним. Именно эти комплексы антигенов с антителами после негативного контрастирования можно наблюдать в электронном микроскопе. В клинической диагностике антигенный материал не требует тщательной очистки. Так, в случае выявления вируса гриппа можно исследовать неочищенную аллантоисную жидкость. В настоящее время считается, что практически любой вид клинического материала пригоден для ИЭМ. В диагностических целях можно применять обычную нефракционированную сыворотку, а также сыворотки реконвалес- центов. Необходимо отметить, что на конечные результаты большое влияние оказывает соотношение количеств антигена и антител. При избытке антигена наблюдают изобилие частиц; агломераты в данном случае будут немногочисленны. При избытке антител вирусные частицы окружены их толстым слоем, выявить мелкие структурные детали вириона практически невозможно; агрегаты также немногочисленны. При оптимальном соотношении количеств антигена и антител агрегаты укрупняются при хорошем изображении деталей вирионов. Из вышеизложенных соображений желательно использовать иммунную сыворотку в нескольких разведениях.

На опорную сетку наносят пленку-подложку, приготовленную из палладия. При использовании низких концентраций палладия и для улучшения адсорбционных свойств подложки ее укрепляют с помощью угля. Для этого на готовую сухую пленку-подложку на электронно-микроскопической сетке напыляют уголь в вакууме. Толщина пленки-подложки и укрепляющего слоя углерода оказывает существенное влияние на контраст и изображение мелких деталей объекта. Конкретную толщину пленок-подложек и слоя угля каждый исследователь определяет индивидуально, исходя из того, что углерод более электронно прозрачен, нежели палладий.

Вирусы и антитела к ним имеют малую электронную плотность. Поэтому биологические объекты невозможно выявлять с помощью электронного микроскопа без предварительной обработки. Для визуализации вирусов используется техника негативного контрастирования (или негативной окраски). Для негативного контрастирования вирусов и комплексов вирус - антитело применяют различные соли тяжелых металлов. Контрастирующие вещества (атомы тяжелых металлов) проникают в гидрофильные участки объектов и замещают в них воду. В результате электронная плотность объекта возрастает, становится возможным его наблюдение в электронном микроскопе.

Прямой метод ИЭМ нашел наибольшее применение в практике. Вирусную суспензию смешивают с неразведенной антисывороткой. После энергичного перемешивая смесь инкубируют в течение 1 ч при

37 °С, затем в течение ночи при 4 °С. На следующий день смесь центрифугируют для осаждения иммунных комплексов. Осадок ресуспен- дируют в капле дистиллированной воды и подвергают негативному контрастированию.

При оценке результатов ИЭМ продукты взаимодействия между антигеном и антителом в электронном микроскопе могут иметь различный вид (отдельная вирусная частица, покрытая антителами полностью или частично; агломераты вирусных частиц). Агломераты могут занимать различную площадь, иметь различный внешний вид, содержать различное количество частиц. Поэтому наряду с опытными необходимо исследовать контрольные препараты (с буферным раствором или гетерологичной антисывороткой).

Критерий оценки результатов, полученных с помощью ИЭМ, - наличие или отсутствие в препаратах скоплений вирусных частиц, агрегированных иммунной сывороткой. Наличие агломератов антигена и антител специфической антисыворотки - признак положительной реакции. Тем не менее следует учитывать возможность неспецифической агрегации частиц антигена под влиянием высокоскоростного центрифугирования. По этой причине многие авторы рекомендуют учитывать результаты по условной шкале от 0 до 4+. Она основана на оценке степени покрытия агрегированных частиц антителами сыворотки.

Методы гемагглютинации и гемадсорбции. Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита - эритроциты барана; вирусы японского энцефалита - эритроциты однодневных цыплят и гусей; аденовирусы - эритроциты крыс, мышей, обезьян. В качестве исследуемого материала в реакции гемагглютинации (РГА) используют аллантоисную, амниотическую жидкости, суспензию хорион-аллан- тоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур клеток или органов животных, зараженных вирусами. Реакцию гемагглютинации можно ставить капельным методом на стекле и в развернутом ряду в пробирках или лунках пластин из полистирола. Первый метод является ориентировочным.

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса.

Смесь выдерживают в термостате, затем добавляют взвесь эритроцитов. Спустя несколько минут определяют титр вируснейтрализующей сыворотки, т.е. максимальное ее разведение, вызвавшее задержку агглютинации эритроцитов.

В серологической диагностике вирусных болезней РТГА рекомендуется ставить с парными сыворотками, одну из которых получают вначале заболевания, а другую - спустя 1-2 недели и более. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз.

Реакцию гемадсорбции (РГадс) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори - эритроциты обезьян; аденовирусами - обезьян и крыс и др.

Реакция нейтрализации (PH). Репродуцируясь в культурах клеток, вирусы вызывают разного рода ЦПД, выражающееся в округлении, сморщивании, уменьшении или, наоборот, увеличении размеров клеток, слиянии их и образовании симпластов, деструкции цитоплазмы и ядра. Наконец, в монослое клеток, зараженных вирусами, в результате разрушения ими отдельных участков клеточного пласта могут появляться «стерильные пятна», или бляшки, представляющие собой клон вирусной частицы, что дает возможность не только изолировать вирус, но и определить его титр.

Идентифицировать вирус по характеру бляшек очень трудно, и поэтому прибегают к постановке PH выделенного вируса заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой.

Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител чаще всего определяют по нейтрализации вирусных гемаг- глютининов в жидкостях эмбриона и устранению смертельного действия вируса на эмбрионы и животных. Одновременно вычисляют индекс нейтрализации, выражающий максимальное количество смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с результатами контрольного опыта, принимаемыми за единицу.

Подобным образом с помощью PH идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных, при заражении им куриных эмбрионов и животных. Для этого к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций определяют динамику нарастания титра вируснейтрализующих антител по известному вирусу. При этом ставят PH с парными сыворотками, взятыми от больных в начале и в конце болезни. Диагностическим явится 4-кратное возрастание титра иммуноглобулинов во второй из них.

PH основана на способности специфических антител достаточно прочно соединяться с вирусной частицей. В результате взаимодействия между вирусом и антителом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате вирус утрачивает способность размножаться в чувствительной к нему биологической системе in vitro или in vivo.

Результаты PH становятся очевидными после того, как смесь вируса и гомологичных ему антител после определенной по времени экспозиции будет внесена в чувствительную биологическую систему (тканевая культура клеток, куриный эмбрион, организм восприимчивого животного), где вирус может размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения, которые будут подавлены частично или полностью в присутствии антител.

В PH участвуют три компонента:

• 1) вирус;
• 2) сыворотка, содержащая антитела;
• 3) биологический объект (лабораторные животные, развивающиеся куриные эмбрионы, тканевые культуры), выбор которого зависит от вида вируса, с которым предполагается проводить исследования.

PH используют либо для идентификации выделенного возбудителя, либо для обнаружения и титрования антител в сыворотках. В первом случае пользуются сыворотками специально иммунизированных лабораторных животных или переболевших людей. Во втором случае используют сыворотки, взятые в начальной стадии болезни и в период реконвалесценции.

Вируснейтрализующие антитела в сыворотках переболевших людей в отличие от антигемагглютининов или комплементсвязывающих антител сохраняются многие годы, а при некоторых вирусных инфекциях (например, при кори) даже пожизненно. Это позволяет в ряде случаев использовать пул сывороток многих реконвалесцентов в качестве референс-препарата, который после разлива в ампулы и лиофилизации пригоден для диагностической работы в течение длительного времени.

При идентификации выделенных возбудителей пользуются заранее приготовленными гипериммунными сыворотками различных животных: кроликов, белых крыс и мышей, морских свинок, обезьян, баранов, лошадей и т.д. Активность гипериммунных сывороток для PH зависит от способа иммунизации животных.

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта вирус предварительно титруют, определяя конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани либо инфицирование лабораторных животных (или куриных эмбрионов). Титр вируса выражают в 50%-ной дозе (ТКИД50 - 50%-ная инфекционная доза для тканевой культуры).

Молекулярно-генетические методы диагностики в вирусологической практике. Методы молекулярной биологии получили свое развитие еще в 50-е гг. XX столетия. Они стали возможными в связи с тем, что в геноме каждого вируса имеются уникальные видоспецифичные нуклеотидные последовательности, обнаружив которые можно идентифицировать любой инфекционный агент. Наибольшее значение данные методы имеют при выявлении микроорганизмов, которые длительно или трудно культивируются обычными методами. В 1970-е годы для выявления инфекционного возбудителя или мутации использовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации специфических олигонуклеотидных зондов, меченных радиоактивным изотопом (или флюорохромом) с образцом выделенной ДНК. Ги- бридизационный анализ использует способность нуклеиновых кислот в определенных условиях образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНК-гибридизацией оказался крайне трудоемким, длительным и дорогостоящим. Кроме того его чувствительность оказывается недостаточной при идентификации микроорганизмов в таких клинических материалах, как фекалии и моча.

На смену ДНК-гибридизации пришел метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК.

Благодаря своим высоким диагностическим качествам ПЦР является общепризнанным дополнением к традиционным методам, использующимся в вирусологии: размножению вируса в культуре клеток, иммунологическому выявлению вирусных антигенов, электронной микроскопии. Существенным преимуществом данного метода является возможность выявлять вирусы при латентных инфекциях (цитомегало- вирус, вирус герпеса) и вирусы, которые трудно или пока невозможно культивировать (вирус иммунодефицита человека, вирус Эпстайна - Барр, вирус папилломы человека, вирус гепатита Видр.). С методом ПЦР связываются перспективы изучения таких заболеваний, как болезнь Крейтцфельдта - Якоба, Альцгеймера, рассеянный склероз.

методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характерцитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяцияфибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные - в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его - клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2-3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов - новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциальногоультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизацияinsitu и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3-5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую - через 2-3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген - антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций - изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

20)Основным структурным компонентом вирионов (полных вирусных частиц) является нуклеокапсид, т.е. белковый чехол (капсид) в котором заключен вирусный геном (ДНК или РНК). Нуклеокапсид большинства семейств вирусов окружен липопротеиновой оболочкой. Между оболочкой и нуклеокапсидом у некоторых вирусов (орто-, парамиксо-, рабдо-, фило- и ретровирусов) находится негликозилированный матриксный белок, придающий дополнительную жесткость вирионам. Вирусы большинства семейств имеют оболочку, которая играет важную роль в инфекционности. Наружный слой оболочки вирионы приобретают, когда нуклеокапсид проникает через клеточную мембрану почкованием. Белки оболочки кодируются вирусом, а липиды заимствуются из мембраны клетки. Гликопротеины обычно в виде димеров и тримеров образуют пепломеры (выступы) на поверхности вирионов (орто-, парамиксовирусы, рабдо-, фило-, корона-, бунья-, арена-, ретровирусы). Гликозилированные белки слияния связаны с пепломерами и выполняют ключевую роль в проникновении вируса в клетку. Капсиды и оболочки вирионов образуются множеством копий одного или нескольких видов белковых субъединиц в результате процесса самосборки. Взаимодействие в системе белок-белок, благодаря слабым химическим связям, ведет к объединению симметричных капсидов. Различия вирусов по форме и размеру вирионов зависят от формы, размера и количества структурных белковых субъединиц и природы взаимодействия между ними. Капсид состоит из множества морфологически выраженных субъединиц (капсомеров), собранных из вирусных полипептидов строго определенным образом, в соответствии с относительно простыми геометрическими принципами. Белковые субъединицы, соединяясь друг с другом, образуют капсиды двух видов симметрии: изометрические и спиральные. Структура нуклеокапсида оболочечных вирусов сходна со структурой нуклеокапсида безоболочечных вирусов. На поверхности оболочки вирусов различают морфологически выраженные гликопротеиновые структуры - пепломеры. В состав суперкапсидной оболочки входят липиды (до 20-35%) и углеводы (до 7-8%), имеющие клеточное происхождение. Она состоит из двойного слоя клеточных липидов и вирусспецифических белков, расположенных снаружи и изнутри липидного биослоя. Наружный слой суперкапсидной оболочки представляют пепломеры (выступы) одного или более типов, состоящие из одной или нескольких молекул гликопротеинов. Нуклеокапсид у оболочечных вирусов часто называют сердцевиной (core), а центральную часть вирионов, содержащую нуклеиновую кислоту, называют нуклеоидом. Капсомеры (пепломеры) состоят из структурных единиц, построенных из одной либо из нескольких гомологичных или гетерологичных полипептидных цепей (белковых субъединиц). классификация вирусов Изометрические капсиды представляют собой не сферы, а правильные многогранники (икосаэдры). Их линейные размеры идентичны по осям симметрии. Согласно Каспару и Клугу (1962), капсомеры в капсидах расположены в соответствии с икосаэдрической симметрией. Такие капсиды состоят из идентичных субъединиц, образующих икосаэдр. Они имеют 12 вершин (углов), 30 граней и 20 поверхностей в виде равнобедренных треугольников. В соответствии с этим правилом капсид полиовируса и вируса ящура образован 60 белковыми структурными единицами, каждая из которых состоит из четырех полипептидных цепей. Икосаэдр оптимально решает проблему укладки повторяющихся субъединиц в строгую компактную структуру при минимальном объеме. Только некоторые конфигурации структурных субъединиц могут сформировать поверхности, образовать вершины и грани вирусного икосаэдра. Например, структурные субъединицы аденовируса на поверхностях и гранях формируют шестигранные капсомеры (гексоны), а на вершинах - пятигранные капсомеры (пептоны). У одних вирусов оба вида капсомеров образуются одними и теми же полипептидами, у других - разными полипептидами. Так как структурные субъединицы разных вирусов различаются между собой, то одни вирусы кажутся более гексагональными, другие - более сферическими. Все известные ДНК-содержащие вирусы позвоночных, за исключением вирусов оспы, а также многие РНК-содержащие вирусы (7 семейств) имеют кубический тип симметрии капсида. Реовирусы, в отличие от других вирусов позвоночных, имеют двойной кап-сид (наружный и внутренний), причем каждый состоит из морфологических единиц. Вирусы, обладающие спиральным типом симметрии, имеют вид цилиндрической нитевидной структуры, их геномная РНК имеет вид спирали и находится внутри капсида. Все вирусы животных спиральной симметрии окружены липопротеиновой оболочкой. Спиральные нуклеокапсиды характеризуются длиной, диаметром, шагом спирали и числом капсомеров, приходящихся на один оборот спирали. Так, у вируса Сендай (парамиксовирус) нуклеокапсид представляет собой спираль длиной около 1 мкм, диаметром 20 нм и шагом спирали 5 нм. Капсид состоит примерно из 2400 структурных единиц, каждая из которых является белком с молекулярной массой 60 кД. На каждый виток спирали приходится 11-13 субъединиц. У вирусов со спиральным типом симметрии нуклеокапсида укладка белковых молекул в спираль обеспечивает максимальное взаимодействие между нуклеиновой кислотой и белковыми субъединицами. У икосаэдрических вирусов нуклеиновая кислота находится внутри вирионов в скрученном состоянии и взаимодействует с одним или несколькими полипептидами, расположенными внутри капсида.

Антирецепторы (рецепторы) Вирусные - поверхностные вирионные белки, напр., гемагглютинин, связывающиеся по комплементарному типу с соответствующим рецептором восприимчивой клетки.

21) Иммунологические методы в вирусологических исследованиях.

Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например lgA-антитела и lgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность И. м. и. превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах. С помощью И. м. и. определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧ-инфекция). При трансплантации тканей и органов И. м. и. позволяют определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакцию Кастеллани для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе И. м. и. изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

В зависимости от их механизма и учета результатов И. м. и. можно подразделить на реакции, основанные на феномене агглютинации; реакции, основанные на феномене преципитации; реакции с участием комплемента; реакция нейтрализации; реакции с использованием химических и физических методов.

Реакции, основанные на феномене агглютинации. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек - носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами. например, для серодиагностики клещевого энцефалита в лунки панели разливают двукратные разведения сыворотки больного на щелочном боратном буферном растворе. Затем добавляют определенное количество, обычно 8 АЕ (агглютинирующих единиц), антигена клещевого энцефалита и после 18 ч экспозиции при t°4° вносят взвесь гусиных эритроцитов, приготовленную на кислом фосфатно-буферном растворе. Если в сыворотке крови больного есть антитела к вирусу клещевого энцефалита, то антиген нейтрализуется и агглютинация эритроцитов не происходит.

Реакции, основанные на феномене преципитации. Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы - полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген - антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

Реакции с участием комплемента, в качестве которого используют свежую сыворотку крови морской свинки, основаны на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам.

Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген - антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций.

Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры патогенность вирусов нейтрализуется и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.

Реакции с использованием химических и физических меток. Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченных флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченное флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген - антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках.

Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции. основанный на выявлении комплекса антиген - антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против lgG-антител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител.

Иммуноферментные, или энзим-иммунологические, методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Подобно иммунофлюоресценции иммуноферментный метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов.

Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов: разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот) путем наложения пластины полиакриламидного геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозу (электроблоттанг); выявления на подложке искомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции. Как диагностический метод иммуноблоттинг используют при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса.

22) Типы симметрии вирусов (кубический, спиральный, смешанный). Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот при упаковке геномов вирусов.

В зависимости от взаимодействия капсида с нуклеиновой кислотой частицы вирусов могут быть подразделены на несколько типов симметрии:

1). Кубический тип симметрии .

Кубические капсиды представляют собой икосайдеры обладающий примерно 20-ю треугольными поверхностями и 12 вершинами. Они формируют напоминающую сферическое образование структуру, но на самом деле это многогранник. В ряде случаев к вершинам таких икосаэдрических многогранников прикрепляются особые липопротеиновые образования именуемые шипами. Роль этих шипов предположительно сводится к взаимодействию вирионов или вирусных частиц с соответствующими участками чувствительных к ним клеток хозяев. При кубической симметрии вирусная нуклеиновая кислота уложена плотно (свернута в клубок), а белковые молекулы окружают ее, образуя многогранник (икосаэдр). Икосаэдр – многогранник с двадцатью треугольными гранями, имеющий кубическую симметрию и приблизительно сферическую форму. К икосаэдрическим вирусам относятся вирус простого герпеса, реовирусы и др.

2). Спиральный тип симметрии . Спиральные капсиды устроены несколько проще. Т.е. капсомеры составляющие капсид покрывают спиральную НК и формируют тоже достаточно стабильную белковую оболочку этих вирусов. И при использовании высокоразрешающих электронных микроскопов и соответствующих методов приготовления препарата можно видеть спирализованные структуры на вирусах. При спиральной симметрии капсида вирусная нуклеиновая кислота образует спиральную (или винтообразную) фигуру, полую внутри, и субъединицы белка (капсомеры) укладываются вокруг нее тоже по спирали (трубчатый капсид). Примером вируса со спиральной симметрией капсида является вирус табачной мозаики, который имеет палочковидную форму, а его длина составляет 300 нм с диаметром 15 нм. В состав вирусной частицы входит одна молекула РНК размером около 6000 нуклеотидов. Капсид состоит из 2000 идентичных субъединиц белка, уложенных по спирали.

3). Смешанный или сложный тип симметрии . Как правило, такой тип симметрии выявляется главным образом среди бактериальных вирусов. И классическими примерами служат те фаги, кишечной палочки или умеренные фаги. Это сложные образования, имеющие головку с внутренним нуклеиновым содержимым, различного рода придатки, хвостовой отросток, разной степени сложности устройства. И каждый компонент таких частиц наделён определённой функцией, реализующейся в процессе взаимодействия вируса с клеткой. Иными словами сложный тип симметрии представляет собой сочетание кубической симметрии, головка – это многогранник икосайдер и палочковидные образования – это хвостовые отростки. Хотя среди вирусов бактерий существуют тоже довольно просто организованные вирионы которые являются примитивными нуклеокапсидами, сферической или кубической формы. Наиболее сложно устроенными являются вирусы бактерий, по сравнению с вирусами растений и вирусами животных.

24)Взаимодействие фага с клеткой. Вирулентные и умеренные фаги.

Адсорбция.

Взаимодействие начинается с прикрепления вирусных частиц к клеточной поверхности. Процесс становится возможным при наличии соответствующих рецепторов на поверхности клетки и анти-рецепторов на поверхности вирусной частицы.

Вирусы используют рецепторы клетки, предназначенные для транспорта необходимых веществ: питательных частиц, гормонов, факторов роста и т.п.

Рецепторы: белки, углеводный компонент белков и липидов, липиды. Специфические рецепторы определяют дальнейшую судьбу вирусной частицы (транспорт, доставка в участки цитоплазмы или ядра). Вирус может прикрепляться и к неспецифическим рецепторам и даже проникать в клетку. Однако такой процесс не вызывает развития инфекции.

Вначале происходит образование единичной связи антирецептрора и рецептора. Такая связь непрочная и может разрываться. Для образования необратимой адсорбции необходимо мультивалентное прикрепление. Стабильное связывание происходит благодаря свободному перемещению молекул рецепторов в мембране. При взаимодействии вируса с клеткой наблюдается увеличение текучести липидов, и формирование рецепторных полей в области взаимодействия вируса и клетки. Рецепторы ряда вирусов могут быть представлены лишь в ограниченном наборе клеток-хозяев. Этим и определяется чувствительность организма к данному вирусу. Таким образом, вирусная ДНК и РНК обладает способностью инфицировать более широкий круг клеток-хозяев.

Антирецепторы могут находиться в составе уникальных вирусных органелл: структуры отростка у Т-бактериофагов, фибры у аденовирусов, шипы на поверхности вирусных мембран, корона у коронавирусов.

Проникновение.

2 механизма – рецепторный эндоцитоз и слияние мембран.

Рецепторный эндоцитоз:

Обычный механизм поступления в клетку питательных и регуляторных веществ. Происходит в специализированных участках - где имеются специальные ямки, покрытые клатрином, на дне ямки располагаются специфические рецепторы. Ямки обеспечивают быструю инвагинацию и образование покрытых клатрином вакуолей (с момента адсорбции проходит не более 10 мин, за одну минуту может образоваться до 2000 вакуолей). Вакуоли сливаются с более крупными цитоплазматическими вакуолями, образуя рецепторосомы (уже не содержат клатрин), которые в свою очередь сливаются с лизосомами.

Слияние вирусной и клеточной мембран:

У оболочечных вирусов слияние обусловлено точечными взаимодействиями вирусного белка с липидами клеточной мембраны, в результате чего вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной. У безоболочечных вирусов один из поверхностных белков также взаимодействует с липидами клеточных мембран и внутренний компонент проходит через мембрану (у парамиксовирусов – F-белок, у ортомиксовирусов – HA2 гемагглютинирующая субъединица). На конформацию поверхностных белков влияет рН.

Раздевание.

При этом процессе исчезает инфекционная активность, часто появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к антителам. Конечный продукт раздевания – нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Стадия раздевания является так же лимитирующей возможность инфекции (вирусы способны раздеваться не в каждой клетке). Раздевание происходит в специализированных участках клетки: лизосомы, аппарат Гольджи, околоядерном пространстве.

Раздевание проходит в результате ряда реакций. Например, у пикорнавирусов раздевание идёт с образованием промежуточных субвирусных частиц с размерами от 156 до 12S. У аденовирусов в цитоплазме и ядерных порах и имеет как минимум 3 стадии:

Образование субвирусных частиц с большей плотностью, чем вирионы;

Образование сердцевин, в которых отсутствует 3 вирусных белка;

Образование ДНК-белкового комплекса, в котором ДНК ковалетно соединена с терминальным белком.

Характеристика вирулентных и умеренных фагов.

При заражении бактерии фагом имеет место так называемая литическая инфекция т.е инфекция завершающаяся лизисом клетки хозяина, но это свойственно только так называемым вирулентным фагам, взаимодействие которых с клеткой приводит к гибели клетки и формированию фагового потомства.

При этом различают следующие этапы по взаимодействиям фага с клеткой: смешивание фага с культурой клеток (множественность инфецирования 1 фаг на 10 клеток), причём концентрация должна быть достаточно высокой, с тем чтобы имелась возможность контактирования фагов с клетками. Чтобы не было повторного заражения – после инфицирования в течение 5 минут максимум, когда фаги адсорбируются – разводится эта смесь клеток с фагом. Выделяется латентный период в течение, которого количество фага не увеличивается, затем очень короткий период выхода, когда резко повышается количество фаговых частиц, когда клетка лизируется и высвобождается фаговое потомство и потом кол-во фагов остаётся на одном уровне, потому что повторного заражения не происходит. На основании этой кривой можно выделить вот эти фазы: вегетативный период «роста» (латентный период), период выхода и рассчитать урожайность фага на 1-у инфицированную клетку. На протяжении латентного периода не удается обнаружить в бактериях ничего похожего на фаговые частицы и не удаётся выделить из таких клеток находящихся в латентном периоде инфекционное начало. Только зрелые фаговые частицы способны вызвать заражение бактерий. Таким образом, вирулентные фаги всегда вызывают гибель бактерий и продуцируют инфекцию, выявляющуюся в продуцировании новых вирусных частиц способных инфицировать следующие и другие чувствительные к ним клетки.

В отличие от вирулентных, заражение умеренными фагам не приводит к лизису бактериальных клеток, а реализуется становление особого состояния сосуществования фага с бактериальной клеткой. Это сосуществование выражается в том, что некое начало фага присутствует в бактериальной клетке без всяких неблагоприятных условий для нее и сохраняется из поколения в поколение. На определенных этапах такого сосуществования фаг активируется в клетке и переходит в состояние литического цикла развития, вызывая лизис клетки и высвобождения фагового потомства. Такие фаги получили название лизогенезирующих или умеренных фагов, а состояние умеренного существования с фагом лизогенией, а бактерии, которые содержат в себе такой скрытый фаг - лизогенных бактерий. Термин лизогенные бактерии происходил из того, что когда-то были обнаружены культуры, у которых спонтанно появлялся фаг, и этот бактериафаг стал рассматриваться как загрязнение культуры, то есть в культуру попадает бактериальный вирус, и такие культуры получили название лизогенных, то есть они генерируют лизис.

Вирусологические исследования - это исследования, предназначенные для выделения вирусов и изучения их свойств, а также установления этиологической связи вирусов с определенными заболеваниями.

Материал для исследования забирается в зависимости от места преимущественного вирусов в организме больного и от путей их выделения во внешнюю среду. Материал собирается в стерильную посуду, максимально быстро доставляется в лабораторию и сохраняется до исследования в замороженном виде или на льду. Перед использованием материал для выделения вирусов обрабатывается ( и ) для подавления посторонней микрофлоры и подвергается для удаления крупных частиц.

Выделение вирусов осуществляется путем заражения вируссодержащим материалом лабораторных животных, куриных эмбрионов, культуры тканей. Выбор способа выделения зависит от предполагаемого возбудителя заболевания. Так, культуры тканей (см.) используют при работе с вирусами, не патогенными для лабораторных животных, или когда в культуре тканей выявляются раньше, чем при инфицировании животных. Куриные эмбрионы заражают для выделения возбудителей , инфекционного паротита (в амниотическую и аллантоисную полости), (в желточный мешок), оспы (на хорионаллантоисную оболочку).

Из лабораторных животных для выделения вирусов наиболее часто используют белых мышей, затем кроликов, крыс, морских свинок, обезьян. Для арбовирусов наиболее эффективно введение вируссодержащего материала в головной или , для пневмотропных вирусов - на слизистую оболочку дыхательных путей, для вирусов оспы, - на скарифицированную роговицу.

Выделение вирусов наиболее эффективно в остром периоде заболевания. Существенным моментом в установлении вирусной природы заболевания являются результаты серологических исследований сывороток, взятых повторно от одного и того же больного в начале заболевания и в период реконвалесценции. Обнаружение антител к выделенным вирусам во второй сыворотке в титре в 4 и более раз больше, чем в первой, указывает на этиологическую связь вирусов с данным заболеванием.

Ранним и быстрым методом обнаружения вирусных антигенов является метод флюоресцирующих антител, основанный на специфической фиксации меченных флюорохромом антител на поверхности антигена. Антиген легко выявляется при люминесцентной микроскопии (см.) благодаря яркой флюоресценции адсорбированных на антигене антител. Методом флюоресцирующих антител исследуют мазки, взятые от больных, гистологические срезы пораженных тканей, препараты из культуры тканей. Для обнаружения элементарных телец (вирионов) применяют также (см.). Из других морфологических методов используют те, которые выявляют внутриклеточные вирусные включения в срезах пораженных органов и тканей. Обнаружение включений свидетельствует об инфекции и в ряде случаев способствует постановке диагноза вирусного заболевания. Для обнаружения вирусных антител в крови больных и для изучения антигенной структуры вирусов применяют различные . Реакцию нейтрализации применяют почти при всех вирусных инфекциях. Она основана на способности антител иммунной нейтрализовать инфекционные свойства вирусов при введении смеси в организм восприимчивых животных или в культуру тканей. Для определения индекса нейтрализации постоянную дозу сыворотки смешивают с различными разведениями вирусов, а для определения титра антител - различные разведения сыворотки с постоянной дозой вирусов. Контролем служит заражение животных (или культуры тканей) смесью вирусов с нормальной сывороткой или с физиологическим раствором. Реакцию нейтрализации ставят не только для выявления антител, но и для определения вида и типа вирусов.

Реакция связывания комплемента [например, Борде - Жангу реакция (см.)] используется для выявления как вирусных антигенов, так и антител. В первом случае в реакции взаимодействуют заведомо известная иммунная сыворотка и материал, в котором предполагается наличие антигенов: сыворотка крови, носоглоточные смывы, экстракты тканей инфицированного организма. Во втором случае - заведомо известный антиген (диагностикум) и сыворотка больного или реконвалесцента.

РСК используется для диагностики заболеваний, вызываемых вирусами гриппа, оспы, аденовирусами и арбовирусами.

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - исследования, проводимые с целью диагностики вирусных инфекций, изучения соответствующих возбудителей, их распространения в природе, а также при производстве вирусных препаратов. В вирусологических лабораториях (см.) мед. профиля изучают как вирусы человека, так в ряде случаев и вирусы животных (напр., проводят диагностику бешенства у собак, обследование животных, используемых для производства вирусных препаратов). Методы исследования тех и других сходны.

Одним из основных этапов В. и. является выделение вирусов. При выделении вирусов от людей используют кровь, различные секреты и экскреты, кусочки органов. Наиболее часто кровь исследуют при арбовирусных заболеваниях. Используется цельная дефибринированная или Гемолизированная кровь, отдельные ее элементы или сгустки (на поздних стадиях заболевания). Вирусы бешенства, эпид, паротита, простого герпеса могут быть обнаружены в слюне. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа, кори, пситтакоза, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы также обнаруживаются аденовирусы. Смыв берут путем полоскания носа и глотки (отдельно) и промывания конъюнктивы изотоническим раствором хлорида натрия. Можно протирать носовые ходы и заднюю стенку глотки тампонами, смоченными бульоном. Нестерильный материал обрабатывают антибиотиками (по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл) в течение 30 мин. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено- и реовирусы. Пробы разводят 1:10 фосфатным буфером, центрифугируют дважды по 20 мин. при 8000 об I мин. Антибиотики прибавляют, как указано выше. Реже для В. и. берут содержимое пустул (при оспе, ветрянке, герпесе) и пунктаты органов (при венерической лимфогранулеме). Секционный материал следует брать как можно скорее после гибели организма. Его хранят до момента исследования при t°-20° и ниже. Для проведения В. и. ткань измельчают (растирают) и готовят 10-20% взвесь на изотоническом растворе хлорида натрия или питательной среде для клеточных культур. Ее центрифугируют 20 мин. при 1500 об/мин; надосадочную жидкость используют для дальнейшего исследования.

С целью выделения вирусов заражают лабораторных животных, эмбрионы птиц, клеточные и тканевые культуры. Животные оказываются пригодными в том случае, если вирус вызывает у них четкие клинические симптомы заболевания или патологоанатомические изменения (напр., параличи, пневмонию и т. п.). От тропизма вируса зависит эффективность того или иного пути введения материала. Широко применяют заражение под кожу, внутрибрюшинно и внутривенно. Нейротропные вирусы выявляют при заражении животных в полушария головного мозга (арбовирусы, вирус бешенства и др.), зрительный бугор (вирус полиомиелита в опытах на обезьянах), спинной мозг. Вирусы оспы и герпеса можно обнаружить путем нанесения материала кроликам на скарифицированную роговицу. Некоторые вирусы легко выявить при инокуляции в переднюю камеру глаза (напр., вирус гепатита собак в опыте на щенках). Для изучения возбудителей респираторных инфекций обычно применяют интраназальное заражение животных (закапывание материала в нос наркотизированным животным или введение его в виде аэрозоля в специальной камере). В пищеварительный тракт материал вводят с пищей или через рот тупой иглой. При изучении некоторых онкогенных вирусов применяют метод заражения золотистых хомячков в слизистую оболочку защечных мешков.

Ко многим вирусам новорожденные животные и сосунки восприимчивее половозрелых особей. Мышей-сосунков широко используют для выделения арбовирусов и вирусов Коксаки (после заражения в мозг). Некоторые аденовирусы способны индуцировать опухоли при подкожном заражении новорожденных золотистых хомячков. Изучение ряда вирусов птиц проводят на цыплятах первых дней жизни.

Использование куриных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Их недифференцированные ткани обладают широким спектром чувствительности в отношении многих вирусов. О наличии инфекции судят по гибели эмбрионов, появлению изменений (оспин) на хорион-аллантоисной оболочке (рис. 1), накоплению в эмбриональных жидкостях гемагглютининов и комплемент-связывающего вирусного антигена. Заражают эмбрионы на хорионаллантоисную оболочку (в возрасте 11 - 12 дней вирусами группы оспы), в аллантоисную и амниотическую полости (10-11-дневными миксовирусами), желточный мешок (в возрасте 5-6 дней возбудителями пситтакозаорнитоза и др.). Инокуляцию материала эмбрионам в мозг и внутривенно (в сосуды оболочек) производят редко. При любом способе заражения эмбрионы могут быть травмированы, поэтому погибших в первые 24-48 час. из учета исключают.

Для изучения действия на вирусы хим. веществ весьма удобны деэмбрионированные яйца, в которых удален эмбрион, но сохранена хорионаллантоисная оболочка. Внутрь помещают вирус и изучаемое вещество в 20 мл изотонического раствора хлорида натрия. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком с трубочкой, через к-рую можно брать пробы для анализа.

При оценке опытов на животных и эмбрионах птиц следует иметь в виду возможность провокации у них латентных инфекций или выделения находящегося в латентном состоянии вируса.

Исключительно широко для выделения и накопления вирусов применяют культуры клеток и тканей (см.). Этими методами можно культивировать большинство известных вирусов (см. Культивирование вирусов). Некоторые из них интенсивно накапливаются уже при первичном заражении культур, для адаптации других требуется несколько пассажей. Размножение большинства вирусов в клеточных культурах сопровождается развитием цитопатического эффекта. По его характеру в известной степени можно судить о принадлежности вирусов к тому или иному роду: пикорнавирусы вызывают округление и сморщивание клеток, аденовирусы - образование округлившимися клетками скоплений в виде виноградных гроздьев, миксовирусы и герпетические вирусы - формирование многоядерных синцитиев. Ряд вирусов культивировать вне организма не удается.

Размножение некоторых вирусов (оспенная группа, миксо- и арбовирусы) можно обнаружить с помощью реакции гемадсорбции, поскольку пораженные клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты. Соответствующие эритроциты (человека, обезьяны, морской свинки, курицы) в концентрации 0,4-0,5% помещают на монослой при t° 4° или при комнатной температуре на 20- 30 мин. Эритроциты адсорбируются диффузно по всей культуре (напр., парагриппозными вирусами) или формируют островки (вирусы гриппа, паротита).

О размножении вируса иногда судят путем исследования культуральной жидкости на животных (клещевой энцефалит) или в РСК. Наличие вируса, не обладающего цитопатической активностью, иногда определяют по его способности интерферировать с цитопатогенным вирусом. Так, в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкозов птиц, подавляется размножение вируса саркомы Рауса. Для обнаружения нецитопатогенных штаммов вирусов диареи крупного рогатого скота и холеры свиней предложен метод END (exaltation of Newcastle disease virus) - суперинфицирование культур вирусом болезни Ньюкасла. При совместном действии обоих вирусов наступает разрушение клеток.

При появлении цитопатических изменений или других признаков размножения вируса культуральную жидкость используют для идентификации вируса или пассажа. Ряд вирусов остается связанным с клетками даже при дегенерации культуры (аденовирусы, вирусы группы оспы), вследствие чего производят замораживание и оттаивание культур перед сбором жидкости. Некоторые герпетические вирусы, напр, вирус болезни Марека у кур, необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками.

Для изучения респираторных корона-вирусов человека и некоторых других используют метод тканевых культур, т. е. заражение культивируемых in vitro тканевых фрагментов. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. Размножающийся вирус поражает клетки эндотелия слизистой оболочки, что определяют по прекращению движения ресничек.

Следует учитывать возможность присутствия в культурах тканей и клеток посторонних вирусов. Они могут быть внесены с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или сыворотки, использованной для культивирования клеток.

Помимо посева биопсийного или секционного материала на уже выращенные культуры, применяют непосредственное культивирование клеток исследуемого органа после его трипсинизации, что нередко более эффективно в отношении выделения вируса (напр., обнаружение аденовирусов в миндалинах). Используют также методику смешанных культур, когда клетки исследуемого органа выращивают вместе с какими-либо чувствительными к данному вирусу клетками (напр., посев клеток мозга больных подострым склерозирующим панэнцефалитом вместе с клетками почек обезьян или Hela-клетками для выделения вируса кори). Метод смешанных культур является зачастую единственным способом выделения вируса из индуцированных им у животных опухолей, которые не продуцируют активного вируса, однако содержат вирусный геном.

Однослойные клеточные культуры дают возможность получить колонии вируса - бляшки (рис. 2). Как правило, бляшки формируют вирусы, обладающие цитопатической активностью. В то же время этот метод позволяет обнаруживать некоторые нецитопатогенные вирусы (напр., ряд штаммов вируса диареи крупного рогатого скота). Для получения бляшек вирус вносят на клеточный монослой в чашках или плоских флаконах. Множественность заражения, т. е. число вирусных частиц на одну клетку, должна быть небольшой, чтобы образовавшиеся бляшки не сливались. После 30-60 мин. адсорбции наслаивают питательную среду с 1,35 - 1,5% агара и нейтральным красным в конечном разведении 1: 40 000. Культуры в чашках Петри инкубируют в атмосфере с 5-10% углекислоты, а герметически закрытые флаконы - в обычном термостате. Через несколько дней среди прижизненно окрашенных клеток начинают выделяться неокрашенные фокусы из дегенерированных клеток.

Можно на клетки помещать агар без нейтрального красного, а через несколько дней нанести второй слой агара с красителем; бляшки становятся видимыми через несколько часов. Агар иногда содержит сульфаты полисахаридов, которые являются ингибиторами роста вирусов; для их нейтрализации в среду добавляют протамин-сульфат (60 мг на 100 мл). Для получения бляшек ряда вирусов можно использовать в качестве покрытия метилцеллюлозу и другие вещества. Некоторые вирусы (оспы, кори) формируют бляшки и без агарового покрытия. Метод бляшек позволяет провести клональный анализ вирусных штаммов. Для выделения генетически однородных клонов извлекают одну бляшку, к-рую используют для следующего заражения. Обычно клонирование проводят на протяжении трех пассажей.

Метод бляшек пригоден также для определения в зараженной культуре количества клеток, продуцирующих вирус (т. е. число инфекционных центров). Для этого клетки суспендируют, помещают на однослойную культуру чувствительных к вирусу индикаторных клеток и заливают агаром. Вокруг зараженных клеток формируются бляшки.

Для диагностики вирусных инфекций и изучения антигенной структуры вирусов применяется реакция преципитации в геле. Чаще всего с этой целью используют агар. Антигены и специфические антитела, помещенные в агаровый гель на определенном расстоянии, диффундируют и образуют при встрече преципитат в виде белых полос. 0,8-1% агар в изотоническом растворе хлорида натрия или фосфатном буфере помещают в капилляры или наносят слоем на предметные стекла. Антигены предпочтительно иметь очищенные и концентрированные. Ингредиенты реакции вносят на агар в противоположные концы капилляра или в лунки, сделанные в слое агара на стеклах на расстоянии 5-6 мм. Инкубация продолжается 4-20 час.

Значительное число В. и. выполняют с помощью световой и электронной микроскопии. Наиболее крупные вирусы (напр., оспы) после соответствующей обработки (серебрение, окраска викторияблау и др.) могут быть выявлены при обычной световой микроскопии. Этот метод применяют при диагностике оспы путем обследования материала из пустул. Характерным для некоторых инфекций является формирование в клетках телец - включений. Так, в ядрах появляются включения при герпетической и аденовирусной инфекции, в цитоплазме - при оспе (тельца Гуарниери) и бешенстве (тельца Бабеша- Негри). Обнаружение включений имеет значение для диагностики бешенства, оспы, цитомегалии, подострого склерозирующее панэнцефалита и др.

Микроскопию в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) и фазово-контрастную микроскопию (см.) используют гл. обр. для изучения динамики изменений в пораженных вирусом клетках. Более широко применяют люминесцентную микроскопию (см.).

Исследуют мазки, отпечатки и выращенные на стеклах однослойные клеточные культуры. Препараты (нативные или фиксированные) чаще всего окрашивают акридином оранжевым. Метод позволяет выявлять крупные вирусы и скопления вирусных компонентов. Образования, содержащие ДНК, светятся ярко-зеленым светом, а содержащие РНК - кирпично-красным. Еще чаще при В. и. производят обработку зараженных клеток флюоресцирующими антителами, что позволяет выявить скопления вирусного антигена. При прямом методе используют иммунный гамма-глобулин, меченный флюоресцентным красителем, напр, флюоресцеин-изотиоцианатом. При непрямом методе препарат обрабатывают обычной иммунной сывороткой какого-либо животного, а затем мечеными антителами против гамма-глобулина этого животного. Препараты просматривают в ультрафиолетовом свете, вирусный антиген обнаруживают по светло-зеленому свечению (см. Иммунофлюоресценция). Метод мазков из носоглотки позволяет проводить раннюю диагностику респираторных вирусных инфекций - гриппозной, парагриппозной, рино- и аденовирусной, респираторно-синцитиальной.

Хим. состав вирусов исследуют общепринятыми хим. методами. Нуклеиновую к-ту обычно получают фенольной экстракцией, реже применяют анионные детергенты - додецил- или лаурилсульфат натрия.

Для идентификации вирусов (см.) в первую очередь следует установить их родовую принадлежность. Для этого необходимо определить размеры и структуру вирусных частиц, вид входящей в их состав нуклеиновой к-ты, наличие липоидной оболочки. Вид нуклеиновой к-ты чаще всего определяют косвенными методами, напр, используя способность бромдезоксиуридина подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов. Наличие липоидной оболочки у вируса устанавливают по его чувствительности к действию эфира и хлороформа (имеющие оболочку вирусы инактивируются). Дальнейшую идентификацию проводят с набором иммунных сывороток к известным вирусам, используя различные реакции - нейтрализации, РСК, РТГА и др. Реже производят иммунизацию животных известным вирусом с дальнейшим их заражением неизвестным или наоборот.

Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974, библиогр.; Лурия G. Е. и Д а р н e л л Дж. Е. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Методы вирусологии и молекулярной биологии, пер. с англ., М., 1972; П ш e н и ч-н о в В. А., Семенов Б.Ф. иЗезе-р о в Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований, М., 1974, библиогр.; Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, М., 1965; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Основными методами, используемыми в диагностике вирусных болезней, являются культивирование и идентификация вирусов.

Для доказательства вирусной этиологии болезни необходимо: выделение вируса из организма больной рыбы, пассирование его на культуре клеток или чувствительных рыбах, воспроизведение болезни у здоровых рыб того же или родственного вида, повторное выделение того же вируса от экспериментальных животных.

Для идентификации вирусов используют несколько взаимодополняющих методов: электронная микроскопия вируса, изучение его физико-химических свойств, обнаружение характерных морфологических изменений в зараженных клетках и симптомов у зараженных животных, различные иммунологические методы.

Вирусы выделяют в основном на однослойных первичных или перевиваемых клеточных культурах, подбирая в каждом случае культуры, чувствительные к данному вирусу. Для получения первичных культур клеток рыб наиболее часто используют гонады самок карпа или карася. Гонады должны быть II или II-III стадии зрелости по шкале Киселевича. Такие гонады не содержат икринок, различимых невооруженным глазом. В противном случае содержимое икринок будет отрицательно влиять на рост клеток. Культуры клеток из гонад карпа и карася готовят по утвержденной методике.

В качестве перевиваемых культур наиболее широко используют следующие клеточные линии: FHM - из тканей хвостового стебля жирноголового гольяна; RTG- из гонад радужной форели; ЕРС - из оспенных разростов на коже карпа. Названные линии поддерживаются в специализированных лабораториях по изучению болезней рыб ветеринарных и рыбохозяйственных научно-исследовательских институтов, где их можно заказать и получить.

При диагностике хорошо изученных вирусных болезней исследуют органы и ткани, где концентрируется возбудитель.

При болезнях рыб, сведения о которых недостаточны, вирусологическому исследованию подвергают наиболее пораженные органы. Соскобы с кожи и жабр, кусочки этих органов вместе со слизью помещают в стерильные флаконы с 2-3 мл стерильного физиологического или буферного раствора. Пробы из внутренних органов берут в строго асептических условиях.

В тех случаях, когда быстро исследовать материал невозможно, его сохраняют не более суток в холодильнике при температуре не выше 5°С. Материал в замороженном состоянии можно сохранять более длительное время.

Предназначенный для исследования патологический материал измельчают в гомогенизаторе или растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Из измельченных тканей готовят 10 %-ную суспензию на растворах Хенкса, Эрла, буферном или физиологическом растворе и центрифугируют 10-15 мин при 2000-3000 об/мин, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой и помещают в стерильные флаконы. Если суспензия не стерильна, подготовленные материалы фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2-0,45 мкм или обрабатывают антибиотиками (пенициллин 1000 ЕД/мл и стрептомицин 1000 мкг/мл).

Из кишечного содержимого готовят 20 %-ную взвесь в стерильной дистиллированной воде и центрифугируют 10-15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость центрифугируют повторно при 4000-5000 об/мин в течение 30 мин. Затем надосадочную жидкость отсасывают в стерильный флакон и обрабатывают антибиотиками. На 1 мл добавляют 1000 мкг/мл стрептомицина и 1000 ЕД/мл пенициллина. Смесь выдерживают 2-3 ч при: комнатной температуре. Все материалы проверяют на бактериальную стерильность путем посева на МПБ и МПА. Приготовленные материалы сразу используют для работы или, в крайнем случае, сохраняют в замороженном состоянии (при температуре минус 20°С).

Заражение культуры клеток . Для заражения используют пробирки с хорошим клеточным монослоем или зоной роста вокруг эксплантата. Питательную среду отсасывают и в каждую пробирку вносят по 0,2-0,3 мл исследуемой суспензии. Одновременно в пробирки добавляют по 0,8-0,9 мл питательной среды с 2-3 % сыворотки.

Материалом, приготовленным из каждой пробы, заражают культуру тканей в 4-6 пробирках. Из каждой серии исследований столько же пробирок оставляют в качестве контроля, добавляя в них по 1 мл питательной среды. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч для адсорбции вируса на клетках, затем отсасывают пипеткой надосадочную жидкость и вносят поддерживающую питательную среду до первоначального объема.

Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре 22-26°С и ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для обнаружения появившихся морфологических изменений в клетках. При выраженной дегенерации клеток культуральную жидкость отсасывают и делают пассажи, а при отсутствии цитопатогенного действия (ЦПД) проводят два последовательных пассажа. Для этого используют культуральную жидкость вместе с клеточной фракцией, разрушенной путем повторного замораживания и оттаивания. Для заражения свежих культур используют надосадочную жидкость центрифугированной клеточной массы. ЦПД после третьего пассажа учитывают как специфическое действие вирусного агента.

Степень поражения клеточного монослоя оценивается по 4-крестовой системе; " + - поражение до 25%, "+ + " - до 50%, "+ + +" - до 75% и "+ + + + " - до 100 % монослоя.

При некоторых вирусных заболеваниях рыб в клетках (цитоплазме ядре) различных органов и тканей появляются тельца-включения. Материалом для исследования вирусных включений служат инфицированные культуры тканей, соскобы и мазки-отпечатки из органов и тканей, казанные материалы перед окраской фиксируют по общепринятым методам, спользуя жидкости Дюбоск - Бразил - Буэна, Буэна, Карнуа или 10 %-ный раствор нейтрального формалина.

Вирусные включения окрашивают различными методами: по Муромцеву, рубиной, Манну, Селлексу, Клисенко, Романовскому-Гимзе, Май-Грюн-альду - Гимзе и др.

Титрование вируса - количественное определение вирусной активности. Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся единице объема суспензии вируса. За инфекционную единицу вируса принимается такая его доза, которая вызывает инфекцию у 50 % зараженных ею чувствительных объектов. Такая доза вируса называется инфекционной и обозначается ИД 50 .

В качестве чувствительных объектов при титровании вирусов рыб используют главным образом культуры клеток. Титрование на культуре клеток осуществляют по цитопатогенному действию вирусов. В этом случае ИД 50 называют тканевой цитопатогенной дозой (ТЦД 50), а титр вируса выражают количеством ТЦД 50 в 1 мл вирусной суспензии. Титр вируса при этом определяют методом конечных разведений. Согласно этому методу чувствительные культуры клеток вводят определенный объем суспензии вируса в последовательно возрастающих разведениях и, учитывая результат к аждого введения как положительный (если есть ЦПД) или отрицательный если ЦПД отсутствует), рассчитывают конечную точку титрования - 1 ТЦД 50 .

Для титрования вирусов, дающих ярко выраженное ЦПД, используют также метод бляшек. При этом зараженный вирусом монослой клеток заливают смесью питательной среды с агаром, чтобы предотвратить перенос вируса на другие клетки, значительно удаленные от первично инфицированных, и иметь возможность инфицировать первоначальные очаги заражения бляшки).

Каждая бляшка возникает из одной инфекционной единицы, которую обозначают БОЕ (бляшкообразующая единица), а титр вируса выражают количеством БОЕ в единице объема суспензии.

Реакция нейтрализации (РН) на культуре клеток .

В основе реакции лежит связывание антигена антителами гомологичной антисыворотки. Реакцию используют для идентификации возбудителей при диаг-остике заболеваний вирусной этиологии. Она позволяет определять по из-естным антителам неизвестный вирусный антиген или по заведомо известному (стандартному) антигену - неизвестные антитела в сыворотках больных ли переболевших рыб.

Определение выделенного вируса в реакции нейтрализации проводят, применяя набор диагностических гипериммунных антисывороток (антител) гомологичных к ним антигенов (вирусов).

Гипериммунные антисыворотки получают при заражении лабораторных животных (например, кроликов) известными штаммами вирусов - возбудителей болезней рыб. У полученных антисывороток определяют титры специфических антител. Для работы берут антисыворотки, содержащие антитела в высоких титрах.

Порядок проведения реакции.

1. Инактивирование нормальной и гипериммунной сыворотки прогреванием при 56 о С в течение 30 мин.

2. Приготовление разведений ингредиентов реакции. Питательной средой без сыворотки и антибиотиков разводят антиген и сыворотки, начиная с 1: 5, 1: 50, 1: 500 и до получения разведения содержанием менее 1 ТЦД 50 /0,2 мл. Гипериммунную сыворотку разводят 1: 2 или 1: 5. При малом титре сыворотку используют неразведенной. Нормальную сыворотку разводят так же, как и гипериммунную.

3. Постановка реакции. В штативе размещают три ряда стерильных пробирок. В первый ряд разливают разведенную гипериммунную сыворотку, во второй - разведенную нормальную сыворотку, в третий - питательную среду. Каждый ингредиент вносят в объеме 0,5 мл.

Приготовленные разведения вируса переносят по 0,5 мл в соответствующие пробирки каждого из трех рядов, причем вирус каждого разведения I переносят отдельной пипеткой, начиная с наибольшего разведения. Таким образом, в каждом ряду пробирок получают последовательные 10-кратные разведения вируса: 10-1, 10-2 и т. д.

Для контроля токсичности сывороток в отдельную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного разведения гипериммунной сыворотки, а затем прибавляют равное количество питательной среды. То же проделывают с нормальной сывороткой.

Пробирки со смесями тщательно встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем заражают культуру клеток каждым разведением вируса (0,2 мл на каждую пробирку) с гипериммунной нормальной сыворотками и питательной средой по 4 пробирки культуры клеток. Параллельно ставят контроли на токсичность используемых клеток и контрольные пробы культуры клеток.

Пробирки с культурой клеток инкубируют в термостате при оптимальной для размножения данного вируса температуре, ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для обнаружения ЦПД вируса. Результаты заносят в таблицу (табл. 11).

Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся в единице объема суспензии вируса. Находят индекс нейтрализации (IN). Он соответствует максимальному количеству ИД 50 , которое может быть нейтрализовано гипериммунной сывороткой. Расчет IN ведут по формуле: lgIN = lgT 1 -lgT 2 , где Т 1 - титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Т 2 - титр вируса в присутствии гипериммунной сыворотки. Значение IN находят по таблице антилогарифмов. Принято считать значение IN до 10 отрицательным, от 10 до 49 - сомнительным, 50 и более - положительным результатом.

Результаты реакции можно считать достоверными только в том случае если гипериммунная сыворотка проверена на специфическую нейтрализующую активность. Для этого предварительно определяют титр нейтрализующих антител в этой сыворотке или ее индекс нейтрализации в реакции с гомологичным вирусом.

Выделение рабдовирусов методом бляшек . Данный метод специфический, применяют его для выделения, предварительного типирования и селекции рабдовирусов карпа, форели при наличии специфических иммунных сывороток для идентификации вируса.

Округлые колонии (бляшки) образуются в клеточных культурах под агаровым покрытием при наличии вируса в исследуемом материале.

В асептических условиях пастеровской пипеткой набирают ткань почек, печени, селезенки и жидкость из брюшной полости, переносят во флакон со средой, содержащей по 500 ME (мкг)/мл антибиотиков в соотношении 1: 10. выдерживают 60-90 мин при температуре 18-22°С, затем центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разводят питательной средой 1: 10 (разведение 1: 100). Для заражения клеточных культур используют надосадочные жидкости обоих разведений.

Для исследования отбирают 3-суточную перевиваемую культуру клеток, выращенную в матрацах с хорошо выраженным монослоем, из расчета 2 матраца на каждое разведение патологического материала и по 2 матраца для контроля. Из флаконов удаляют питательную среду и вносят по 2 мл среды без эмбриональной сыворотки. Затем вносят по 0,2 мл исследуемого патматериала и оставляют для адсорбции вируса на 60 мин при температуре оптимальной для вирусов, поражающих рыб (для вирусов карпа - 24-26°С и для вирусов форели-16-18°С).

Контроль ставят в 2 матрацах с клеточными культурами по 0,2 мл, содержащих по 100 ТЦД 50 /мл известного вируса, а в 2 - по 0,2 мл питательной среды без вируса.

Через 60 мин жидкость из флаконов удаляют. По стенке, противоположной монослою, вносят во флакон емкостью 50 мл 5 мл агарового покрытия, нагретого до 40-42°С (при выделении вируса ВГС - не более 38°С). Матрацы поворачивают монослоем вниз, покрывают черной бумагой. Через 15-20 мин матрацы переносят для инкубации при оптимальной для изучаемых вирусов температуре. Матрацы кладут агаровым покрытием вверх. При неизвестном вирусе культуры содержат при двух температурных режимах - 14-18 и 22-24°С.

Зараженные клеточные культуры просматривают на белом фоне. При наличии в изучаемом материале вируса в клеточной культуре вначале появляются прозрачные точки на розово-матовом фоне культуры. В дальнейшем они увеличиваются в размере, образуя круглые прозрачные колонии - бляшки, наличие которых свидетельствует о наличии в патматериале рабдовирусов.

Пастеровской пипеткой набирают кусочек бляшки на границе пораженной и непораженной части с таким расчетом, чтобы попал не только агаровый, но и клеточный слой. Отобранный кусочек помещают в пробирку с 1 мл ростовой среды, замораживают при минус 20°С и выдерживают 60 мин. В случае большого количества бляшек (весь клеточный слой прозрачный) исследования повторяют в разведениях 10 -3 и 10 -4 .

Бляшки диаметром 3-8 мм рабдовируса карпа на перевиваемой культуре ЕРС и FHM, инкубируемой при температуре 24-26°С, проявляются на 4-7-й день.

При отсутствии бляшек и наличии ЦПД в клеточных культурах проводят дополнительные исследования вируссодержащей культуральной жидкости в разведениях 10 -2 -10 -3 (2-3 пассажа). В качестве дополнительных методов идентификации вирусов используют: метод флуоресцирующих антител; определение чувствительности вируса к хлороформу, эфиру, величине рН, нагреванию; электронно-микроскопическое исследование морфологии вирусов.