Метод висячей и раздавленной капли. Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)
Приготовление фиксированного препарата и окраска его по Граму
А. Приготовление фиксированного препарата.
Препараты бактерий готовят на предметных стеклах, которые должны иметь толщину, не превышающую 1,2-1,4 мм. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена. В повседневной работе достаточно натереть сухое чистое стекло сухим хозяйственным мылом, после чего тщательно протереть сухой хлопчатобумажной салфеткой; на хорошо обезжиренном стекле капля воды равномерно расплывется (не сохраняет каплевидную форму).
На обезжиренное предметное стекло наносят небольшую каплю водопроводной воды и переносят в неё профламбированной (стерильной) биологической петлей незначительное количество исследуемого материала. Биомассу бактерий вращательным движением петли растирают в капле воды на площади примерно 4 см 2 . Слой должен быть настолько тонким, что мазок высыхает почти сразу после приготовления.
Высушивание мазка следует проводить при комнатной температуре на воздухе. Если оно замедлено, то препарат можно слегка нагреть в токе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая препарат, иначе клетки микроорганизмов деформируются.
Фиксация мазка преследует несколько целей: убить микроорганизмы, приклеить их к стеклу, обеспечить лучшее окрашивание. Для того, чтобы зафиксировать мазок, нужно три раза провести предметное стекло через самую горячую часть пламени горелки, держа его мазком вверх.
Б. Окраска препарата по Граму .
На зафиксированный мазок помещают фильтровальную бумажку и наносят краситель генцианвиолет на 1,5-2 мин. (на этой стадии операции необходимо следить, чтобы краситель проходил на мазок через фильтр). Далее фильтровальную бумагу убирают и наносят на мазок раствор Люголя также на 1,5-2 мин. Раствор Люголя сливают и обрабатывают мазок 96%-м этиловым спиртом в течение 30 сек. Затем мазок промывают водой, докрашивают фуксином Циля (1,5-2 мин.) и промывают водой до «светлой капли». Далее мазок высушивают, наносят на него иммерсионное масло и изучают в микроскопе при увеличении объектива 90 х.
Методы исследования живых клеток
А. Препарат «раздавленная капля»
На обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в неё небольшое количество культуры изучаемых микроорганизмов. Взвесь бактерий размешивают и прикрывают покровным стеклом. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания её покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бумагой, которую затем следует сразу опустить в дезинфицирующий раствор.
Б. Препарат «висячая капля» .
Каплю суспензии микроорганизмов биологической петлей наносят на покровное стекло, которое затем переворачивают каплей вниз и помещают над лункой специального предметного стекла (стекло с лункой). Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином для герметизации камеры.
В. Препарат «отпечаток»
Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат (покровное стекло) помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии предметным стеклом.
Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. После микроскопирования такие препараты перед мытьем должны быть выдержаны в дезрастворе.
Цитохимические методы исследования строения микробов
А. Окраска капсул и приготовление красителей
а) Окраска капсул
Для окраски капсул применяют методы Михина, Ольта, Ребигера, Романовского-Гимза, Гинса, негативный метод Бурри.
Метод Михина. Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффлёра в течение 2-3 мин. при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листами фильтровальной бумаги. Клетка окрашивается в темно-синий цвет, капсула - в светло-розовый.
Метод Ольта. Фиксированный препарат окрашивают 2-3%-м водным раствором сафраина в течение 1-3 минут (лучше при подогревании) и быстро промывают водой. Раствор сафраина готовят перед употреблением, растворяя краску в воде, доведенной до кипения, затем фильтруют через бумажный фильтр. Клетки окрашиваются в красно-коричневый цвет, капсулы - в бледно-желтый.
Метод Ребигера. Окрашивают и фиксируют препарат одновременно формалиновым раствором генцианвиолета. Нефиксированные мазки окрашивают 15-20 сек., быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Клетки окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, капсулы - в красновато-фиолетовый.
Метод Романовского-Гимза. Краску фабричного приготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Разведенную краску наливают на дно чашки Петри, в которую кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, зафиксированный метиленовым спиртом, помещают в чашку до соприкосновения с краской (бактерии находятся на нижней плоскости мазка). Окрашивание проводят 30-40 минут. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Клетки окрашиваются в сине-фиолетовый, а капсулы - в красно-фиолетовый цвета.
Негативный метод Бурри. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю туши, разведенную в 10 раз дистиллированной водой. В тушь вносят каплю исследуемой культуры и хорошо смешивают. Полученную взвесь другим стеклом равномерно распределяют по поверхности предметного стекла, высушивают на воздухе. Препарат рассматривают с иммерсией. На темно-дымчатом фоне хорошо видны неокрашенные капсулы и клетки бактерии.
Метод Гинса. На край предметного стекла наносят каплю туши, вносят в неё клетки, хорошо перемешивают и ребром другого стекла делают мазок по всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5-10 минут жидкостью Никифорова или 3 минуты абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивается фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания 2-3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией. На темно-сером фоне выделяются розово-малиновые клетки, окруженные бесцветными капсулами.
Окраска капсул бактерий по Муромцеву. На фиксированный мазок наносят краситель Муромцева на 30-40 сек., мазок промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. Микроскопическая картина - капсулы розовые, бактерии - темно-синие.
б) Приготовление красителей для окраски капсул.
Синька Леффлера. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-го этилового спирта.
30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-го раствора КОН.
Раствор КОН : 0,01 г КОН развести в 99,99 мл дист. воды.
Раствор сафраина. 3 г сафраина смешать с 97 мл дистиллированной воды, довести до кипения, профильтровать. Краска готовится перед употреблением.
Формалиновый раствор генцианвиолета. 15-20 г генцианвиолета растворить в 100 мл 40%-го формалина, оставить на 6-8 часов при комнатной температуре, профильтровать, после чего он готов к употреблению.
Краситель Романовского-Гимза. Готовый реактив разводят перед употреблением: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.
Смесь Никифорова. Этиловый спирт и серный эфир в равных объемах.
Комбинированная краска по Муромцеву. Первый раствор - фуксин основной - 0,15 г, спирт этиловый 96%-й - 20 мл, карболовая кислота кристаллическая (фенол) - 10 г. Второй раствор - метиленовый голубой - 2,5 г, вода дистиллированная - 200 мл. Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.
Кислотоустойчивость - свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость связана с особенностью химического состава клеточной стенки этих бактерий: в ней содержится много сложных липидов и миколовых кислот.
На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На препарат помещают фильтровальную бумагу и заливают карболовым фуксином Циля и затем 2-3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку; при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ой серной кислотой. Для этого предметное стекло 2-3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3-5 минут синькой Леффлера. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсией. Кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Кислотоустойчивость можно определять у клеток любого возраста.
Реактивы для определения кислотоустойчивости.
Фуксин Циля. 5 %-й раствор свежеперегнанного фенола 100%, насыщенный спиртовой раствор фуксина основного - 10 мл. Приготовленную смесь отфильтровывают через 48 часов. Краситель устойчив при хранении.
Другой способ получения фуксина Циля: фуксин основной - 1 г, фенол кристаллический - 5 г, спирт 96 %-й - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл. Основной фуксин растворяют в этаноле, затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.
В. Окраска спор и приготовление реактивов.
а) Окраска спор
Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток.
Эндоспоры обладают многослойными труднопроницаемыми оболочками, поэтому при простой обработке препарата спорообразующих бактерий фуксином или генцианвиолетом споры не окрашиваются. При микроскопировании они обнаруживаются в клетке в виде бесцветных включений. Свободные споры имеют вид колец.
Метод Пешкова. Мазок готовят на обезжиренном предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленовой сини по Леффлёру. Краситель доводят до кипения, держа стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания, - 10-20 сек. Затем предметное стекло охлаждают, тщательно промывают водой и докрашивают в течение 30 сек. 0,5%-м водным раствором нейтрального красного или сафраина. Краситель сливают, мазок промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры - синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать другой краситель - малахитовый зеленый. В этом случае фиксированный препарат заливают на 7-10 минут 7,5%-м раствором малахитового зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают и докрашивают 0,25%-м водным раствором сафраина в течение 1-2 минут. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый.
Метод Циля - Нильсена в модификации Мюллера. На фиксированный над пламенем мазок наливают 5%-й водный раствор хромовой кислоты, которую через 5-10 минут смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров, но не до кипения, потом отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя (так в течение 7 минут). При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения мазка её снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Поэтому для обесцвечивания цитоплазмы препарат затем обрабатывают 1%-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15-30 секунд. При превышении этого времени может обесцветиться и спора. Затем препарат промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получиться контрастной и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.
б) Реактивы для окрашивания спор бактерий
1. Карболовый фуксин Циля (см. выше).
2. Метиленовый синий Леффлёра (см. выше).
3. Насыщенный водный раствор метиленового синего: 2 г красителя растворить в 100 мл дистиллированной воды.
4. Хромовая кислота, 5%-й раствор.
5. Кислота соляная или серная, 1%-й раствор.
6. Сафраин, водный раствор: 2,5%-й раствор сафраина в 96%-м этаноле - 10 мл, вода дистиллированная - 100 мл.
7. Малахитовый зеленый: малахитгрюн - 7,5 г, вода дистиллированная - 92,5 мл.
8. Метиленовый синий насыщенный спиртовой раствор: метиленовый синий - 3 г, 96%-й спирт - 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 дня, несколько раз перемешивают, потом фильтруют. Раствор устойчив.
9. Метиленовый синий по Леффлёру (другой рецепт): 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего растворить в 100 мл дистиллированной воды, добавить 1 мл 1%-го водного раствора КОН.
Г. Окраска жгутиков
а) Приготовление препарата
Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает толщину жгутиков. Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается в диаметре и они становятся видимыми в световом микроскопе. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки культуры и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании культуры.
Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы культуры на свежую питательную среду в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованной среды. Кроме того, в день просмотра можно брать петлей материал и переносить в пробирку с 5-6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37°С. Не рекомендуется болтать петлей в воде, бактериальная масса сама должна в течение 30-60 мин разойтись в ней.
Прежде чем приступить к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1,5-2 суток.
Для приготовления препаратов необходимы совершенно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-м спиртом. Пред приготовлением мазка следует сильно нагреть ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, но наносить его надо на охлажденное стекло.
б) Методы окрашивания.
Метод Леффлёра. Суспензию бактерий наносят на стекло пастеровской пипеткой или петлей (3-4 маленьких капли) и сушат при комнатной температуре. Допускается фиксация мазка быстрым одноразовым проведением через пламя. Далее препарат заливают протравой на 3-5 минут при нагревании до появления паров или 15-20 минут при комнатной температуре, потом промывают сильной струей дистиллированной воды 30 сек. и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат карболовым фуксином Циля 3-4 минуты при легком нагревании до появления пара (фуксин содержит 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды, или в соотношении 1:1). Затем препарат промывают водой и исследуют с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.
Метод Фонтана. В пробирку с 0,5 мл стерильной водопроводной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсационной водой. Материал берут осторожно, слегка касаясь культуры, а не вести биологической петлей по поверхности агара. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 час. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. Затем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят на обезжиренное предметное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксируют 5 минут жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой (см. ниже) и подогревают стекло до появления паров в течение 2 минут. Протраву сливают, препарат тщательно промывают водой. Далее обработку препарата проводят серебрением: разбавленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2-х минут до появления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Бактерии в препарате окрашены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики (часто спутанные) - в светло-коричневый или желтый.
Метод серебрения жгутиков по Морозову. Препарат готовится, как описано выше. На препарат наливают на 1 минуту реактив №1. Затем его сливают, промывают водой и наливают реактив №2. Подогревают на слабом пламени до появления паров, тщательно промывают водой и 1-2 минуты (при подогревании) обрабатывают препарат реактивом №3 до появления темно-коричневой окраски мазка. Мазок тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.
в) Реактивы для окраски жгутиков.
Приготовление протравы : 12 г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного раствора железного купороса FeSO 4 и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-м спирте. Смесь готовят за несколько дней до употребления, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Перед употреблением фильтруют.
Краситель : карболовый фуксин Циля и дистиллированная вода в соотношении 1:1. Готовят перед употреблением и фильтруют.
Реактив №1 : 1 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл формалина 40%-го, 100 мл дистиллированной воды. Это жидкость Руге.
Реактив №2 : протрава - танин (5 г), фенол кристаллический (1 г) и дистиллированная вода (100 мл).
Реактив №3 (реактив для серебрения): азотнокислое серебро - 5 г, раствор аммиака, вода дистиллированная - 100 мл. К 3-4 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра по каплям прибавляют раствор аммиака до помутнения и образования осадка, а затем осторожно до растворения осадка. После этого вновь прибавляют раствор серебра до появления легкой опалесценции. Полученный раствор аммиачного серебра разводят дистиллированной водой в 10 раз.
Д. Окраска включений клеток микроорганизмов
Окраска гликогена. Гликоген - животный крахмал часто накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для выявления гликогена к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют гранулы гликогеноподобных веществ, окрашенные в красновато-коричневый цвет.
Окраска гранулёзы. Гранулеза - крахмалоподобное вещество. Гранулеза в больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Анализ проводят аналогично выявлению гликогена. Гранулеза окрашивается в синий цвет.
Окраска жира. Жир содержится в клетках почти всех микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.
На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет оболочку. Через 5 минут добавляют каплю метиленового синего и спустя 10 минут каплю судана III - индикатора жироподобных веществ. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашиваются в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.
Бактерии в качестве резервных липидов образуют гранулы поли-бета-оксимасляной кислоты. Для их выявления готовят фиксированный мазок, окрашивают суданом черным или суданом III в течение 5-15 минут (краситель при этом может высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него препарат. Время просветления препарата в ксилоле не должно превышать 1 минуту. После этого клетки дополнительно окрашивают 0,5%-м раствором сафранина в течение 5-10 сек. Включения поли-бета-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.
Окраска полифосфатов (волютин, метахроматин). На тонкий, зафиксированный на горелке мазок, наносят метиленовую синь по Леффлеру и окрашивают в течение 10 минут. Краситель сливают, промывают, просушивают, микроскопируют с иммерсией. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютин - в фиолетово-красный.
Окраска волютина по Омелянскому. На фиксированный в пламени мазок наносят фуксин Циля и окрашивают клетки 0,5-1 минуту. Промывают препарат водой и обесцвечивают 1%-м раствором серной кислоты в течение 20-30 сек. Кислоту сливают, мазок промывают водой и дополнительно докрашивают метиленовым синим (в разведении 1:40) 20-30 сек. Препарат вновь промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.
Окраска волютина по Муромцеву. Тонкий фиксированный смазок культуры микроба окрашивают краской по Муромцеву 1 минуту. Мазок промывают водой, сушат и микроскопируют с иммерсией. Зёрна волютина окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма - в голубой.
Препараты для окрашивания включений.
1. Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы: йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 3 г, вода дистиллированная - 300 мл.
2. Судан III - 0,5 г, молочная кислота концентрированная - 100 мл.
2-а. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-го спирта или концентрированной молочной кислоты.
3. Судан черный В - 0,3 г, 100 мл 70%-го горячего этилового спирта. Раствор выдерживают несколько часов в закупоренной склянке при 60°С, затем охлаждают и фильтруют.
4. Метиленовый синий 1:40. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего - 1 мл, вода дистиллированная - 40 мл.
Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов
а) Методы выявления
Метод Романовского-Гимза. Препарат фиксируют метиловым спиртом или фиксатором Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают этиловым спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (pH 7,2), высушивают и микроскопируют с иммерсией. Ядерные вещества окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.
Реакция Фельгена. Препарат обрабатывают фиксатором Карнуа в течение 5 мин., промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 минут в растворе 1н. соляной кислоты, подогретой до 60°С, погружают на 1-2 минуты в холодную 1н. соляную кислоту и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3-4 часа. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 минут в каждой, затем споласкивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Ядерное вещество окрашивается в фиолетовый цвет.
Модификация метода Фельгена. После гидролиза в соляной кислоте препарат немедленно промывают водой и помещают на 15 минут в 1%-й раствор формалина. Вновь промывают водой и окрашивают в течение 1-2 минут 0,1-1%-м водным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают, исследуют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.
б) Реактивы для выявления нуклеоида.
1. Фиксатор Карнуа: 96%-й этиловый спирт - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислота - 10 мл (время фиксации - 15 минут).
2. Краситель Романовского-Гимза: состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Перед употреблением к 10 мл красителя добавляют 10 мл дистиллированной воды (pH 7,2).
3. 1н. соляная кислота.
На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. ! Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его
Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру
Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х
Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
Метод висячей капли
Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина (рис. № 10)
На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре
Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время
Микроскопия сначала при увеличении 8Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40Х (рис. № 11).
Рис. №10 . Техника приготовления препарата висячая капля
Рис. №11 . Лептоспира в темном поле
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №6
Зачетное занятие с замером навыков по теме:
«Морфология микроорганизмов»
Перечень манипуляций к зачету:
Подготовить препарат и окрасить его по методу Грама. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Ожешко. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Бурри-Гинса. Значение метода
Подготовить препарат, окрасив его по методу Циля-Нильсена (1999г). Значение метода
Подготовить препарат висячая капля, значение методики
Подготовить препарат раздавленная капля, значение методики
Промикроскопировать готовые препараты, окрашенные различными методами: по Граму, Ожешко, Бурри-Гинсу, Циля-Нильсену.
Вопросы к зачету:
Назовите основные формы бактериальных клеток,
Перечислите основные и дополнительные структуры прокариотической клетки, их функции,
Укажите состав и строение жгутиков, группы бактерий по расположению жгутиков,
Назовите строение и функции нуклеоида у прокариот,
Укажите, что собой представляет спора и ее значение для бактерий, расположение спор в клетке (примеры микробов).
Тестовые задания для самоконтроля
1. Расставьте этапы приготовления препарата в нужном порядке:
а) окрашивание
б) фиксация
в) приготовление мазка
г) высушивание
2. Укажите соответствие между возбудителем и методом его окраски:
стафилококк а) по Граму
микобактерия туберкулеза б) Циля - Нильсену
пневмококк в) Бурри - Гинсу
бацилла сибирской язвы г) Ожешко
3. Простой метод окраски:
а) по Нейссеру
б) метиленовым синим
в) по Граму
г) по Романовскому - Гимзе
4. Хранителем наследственной информации у прокариот является:
а) нуклеоид
в) включения
г) капсула
5. Окраска по методу Бурри отличается от метода Бурри-Гинса:
а) по времени окрашивания
б) отсутствия фуксина Пфейффера
в) разные разведения туши
г) мазок фиксируется в пламени горелки
6. При окраске препарата методом Циля-Нильсена (инструкция 1999г.) используется:
в) 5% Н 2 SО 4
г) 25% Н 2 SО 4
7. К спорообразованию способны:
а) стафилококки
б) бациллы
в) сарцины
г) кишечная палочка
8. В методике окраски по Бурри-Гинсу используется черная тушь, разведенная в
9. Укажите соответствие:
Метод окраски: Цель метода:
метод Ожешко а) обнаружение капсулы
метод Бурри б) определение кислотоустойчивости
метод Циля-Нильсена в) отношение к Граму
4. метод Грама г) определение споры
10. При изучении подвижности используется микроскопия: а) фазово-контрастная
б) темнопольная
в) электронная
г) люминисцентная
11. Гонококки - это шаровидные бактерии, в мазках выглядят как:
а) диплококки
б) сарцины
в) микрококки
г) тетракокки
12. При окраске по Граму используется следующий краситель:
а) фуксин Циля
б) метиленовый синий
в) бриллиантовый зеленый
г) генциановый фиолетовый
13. Спору у бактерий можно выявить, окрасив препарат:
а) метиленовым синим
б) методом Ожешко
в) методом Грама
г) по Бурри-Гинсу
14. Флагеллин - это белок, входящий в состав:
а) оболочки
б) капсулы
в) цитоплазмы
г) жгутиков
15. Укажите соответствие:
Вид микроскопии: Цель применения:
1) Световая обычная микроскопия а) для изучения живых неокрашенных
препаратов
2)Фазово-контрастная микроскопия б) для изучения окрашенных препаратов
16. Перетрихи - имеют следующее расположение жгутиков на клетке:
а) по всей поверхности
б) на обоих концах
в) пучок на одном из концов
г) один жгутик на конце клетки
17. Виды фиксации:
1) физический а) пламя горелки, б) смесь Никифорова,
2) химический в) ацетон, г) спирт
18. Предметное стекло с лункой используется:
а) в методе Циля-Нильсена
б) изучение подвижности
в) изучения на наличие капсулы
г) при обнаружении споры
19. Дополнительной структурой бактерий является:
а) нуклеоид
в) капсула
г) рибосомы
20. Препарат из нативного материала готовится при окраске:
б) Бурри - Гинса
в) Ожешко
г) Циля-Нильсена
21. Бактерии штопорообразной формы называют:
а) спирохеты
б) спириллы
в) вибрионы
г) бруцеллы
22. Негативные методы окраски используются при методе:
а) Бурри-Гинса
б) Циля-Нильсена
г) Ожешко
д) Нейссера
23. В состав клеточной стенки бактерий входит:
а) крахмал
б) муреин
в) альбумин
24. Методы изучения микроорганизмов:
а) серологические
б) бактериологические
в) аллергические
г) все ответы верны
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
2 – б, в, г
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. – Ростов н/Д: Феникс, 2003 г.
Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. М., «Медицина», 1976
Микробиология /Под ред. Ф.К. Черкес. – М.: Медицина, 1986 г.
Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебник / А.А.Воробьев, Ю.С. Кривошеин, А.С. Быков и др. Под ред. А.А. Воробьева и Ю.С. Кривошеина. – М.: Мастерство; Высшая школа, 2001 г.
Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений. – Ростов н/Д: Феникс, 2002 г.
Руководство для малого практикума по микробиологии, П.А.Чиров, З.И.Остроухова, Е.И.Тихомирова, Изд-во СГУ, 1998 г.
Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник для средних медицинских учебных заведений / В.Б. Сбойчаков. – СПб.: СпецЛит, 2007г.
ПРИЛОЖЕНИЕ №1
Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии
Правила работы со спиртовкой
Заправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля
При зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т.к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта
Нельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т.к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт
Нельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком.
Необходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва
При длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками
Не следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т.к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание
Правила пользования ручным химическим пенным огнетушителем
ОХП -10
В случае возникновения пожара необходимо:
Для приведения огнетушителя в действие – ручку верхней части корпуса поворачивают на 180 о и переворачивают огнетушитель вверх дном
Струю пены следует направлять не в центр пламени, а под минимальным углом к поверхности горения в нижнюю часть пламени, последовательно сбивая и оттесняя его от краев к центру
При тушении огня ОХП – 10 необходимо обесточить все помещения с помощью рубильника, т.к. химическая пена в составе огнетушителя обладает высокой электропроводностью
ОХП – 10 применяют для тушения крупных очагов возгорания, когда другие средства малоэффективны
Правила работы с живой культурой
Правила работы с нагревательными приборами
При работе с электроплитками склянки с огнеопасными жидкостями следует держать на расстоянии не менее 1 м от рабочего места
Работать на неисправном и незаземленном оборудовании категорически запрещается
При временном прекращении работы, даже на непродолжительное время, источники нагревания выключать
Нельзя нагревать толстостенную стеклянную посуду, мерную посуду, неградуированные цилиндры. Фарфоровую посуду (стаканы, выпарительные чашки) можно нагревать на открытом пламени или водяной бане
Стеклянную посуду с плоским дном нагревать на открытом пламени или электроплитке с открытой спиралью нельзя
ПРИЛОЖЕНИЕ №2
Правила работы в микробиологической лаборатории
Работа с заразным материалом требует особой тщательности и соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее выполнении
В помещении лаборатории необходимо строго соблюдать чистоту и порядок. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов. Запрещается прием пищи, излишние разговоры, суета
Работа обязательно проводится в халате, шапочке, сменной обуви
Каждый студент имеет в лаборатории свое постоянное рабочее место
Материал для работы принимает дежурный по бригаде у лаборанта и раздает студентам в присутствии преподавателя
В начале занятия необходимо записать в тетрадь дату, номер, тему занятия, план выполняемой работы. В процессе работы делаются записи и зарисовки в дневник
Все предметы, использованные при работе с живой культурой, обезвреживаются
В конце занятия студенты сдают весь материал дежурному по бригаде, а он лаборанту или преподавателю
В конце занятия студент должен:
Привести в порядок свое рабочее место
Сдать микроскоп, материал дежурному
Вымыть руки дез. раствором, а затем мылом
Представить преподавателю для подписи дневник
Анна Вадимовна Палиенко
Руководство для студентов отделения 060110 «Лабораторная диагностика»
к практическим занятиям
по курсу «Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований»
раздел «Морфология микроорганизмов»
Каждая женщина хочет быть привлекательной, нравиться себе и окружающим её людям. С возрастом оставаться в форме становится сложнее: появляются морщинки, кожа обвисает, теряет блеск и увлажнённость. Многие женщины в погоне за вечной молодостью практически «живут» в косметологических салонах, клиниках, подвергая себя и своё тело бесчисленным процедурам. Зачастую в результате они выглядят только хуже, а исколотое, например, ботоксом лицо становится неподвижной «маской». Стоит ли красота таких жертв? Сомневаемся. К счастью, косметология не стоит на месте, появляются разные процедуры, которые не причиняют вреда. Среди них — .
Это подкожные инъекции, которые омолаживают кожу, не причиняя ей вреда. Это неудивительно, ведь название процедуры в переводе означает «естественное возвращение жизни». Биоревитализация гиалуроновой кислотой не оставляет на коже травм и абсолютно безопасна. Кроме того, коже не нужно будет тратить время на восстановление.
Гиалуроновая кислота содержится в естественном виде содержится в организме человека, однако с возрастом её становится меньше. Именно поэтому наша кожа начинает увядать, теряет упругость. Поэтому косметологи придумали вводить под кожу искусственную гиалуроновую кислоту.
Показания к процедуре биоревитализации
Биоревитализация вам необходима, если:
- у вас есть проблемы после пластических операций;
- имеются пигментные пятна;
- ваша кожа увядает и теряет блеск.
Почему Вискодерм?
Линейка препарата ВискодермПрепарат Вискодерм — детище итальянской компании IBSA, одного из производителей гиалуроновой кислоты.
В отличие от аналогов, этот препарат совершенно безвреден. Он делается из искусственной гиалуроновой кислоты, поэтому не вызывает аллергии. Поэтому вы можете без страха применять Вискодерм, чтобы омолодить кожу. Эффект от процедуры заметен сразу, поэтому отзывы о Вискодерме положительные.
Линейка препаратов Вискодерм, состав, показания к применению
Вискодерм 0,8%
В геле содержится 8 миллиграммов гиалуроновой кислоты. Рекомендуется для решения следующих проблем:
- омоложение кожи вокруг глаз;
- коррекция, а также профилактика кожного старения;
- истончившаяся, лишенная влаги кожа;
- коррекция последствий угревой сыпи, рубцов и небольших растяжек;
- удаление дефектов кожи лица, вызванных курением и стрессами.
Вискодерм 1,6%
Такая концентрация геля содержит 16 миллиграммов гиалуроновой кислоты и рекомендуется для:
- устранения сухости кожи;
- коррекции кожных изменений, связанных со старением, особенно после 30-40 лет;
- удаления излишней инсоляции;
- подготовки к агрессивным косметическим процедурам (химический пилинг);
- омоложения рук, шеи, зоны декольте, лица;
- увеличения эффективности контурной пластики губ при помощи гиалуроновой кислоты.
Вискодерм 2 %
В геле с таким названием содержится 20 миллиграммов гиалуроновой кислоты. Он используется для:
- коррекции старения сорокалетней кожи;
- заполнения глубоких морщинок и сладок кожи;
- омоложения тяжелой толстой кожи.
Эти виды препарата Вискодерм относятся к основной линейке. Также выпускается ещё три типа, которые отличаются большей дозировкой.
Вискодерм Bi 0,8%
- 8 миллиграммов гиалуроновой кислоты (один шприц объёмом 2 миллилитра).
Вискодерм Trio 1,6%
- биоревитализация большой кожной поверхности.
- 16 миллиграммов гиалуроната натрия (три шприца по 1,5 миллилитра).
Вискодерм Maxx 2%
- биоревитализация изменений кожи, связанных с возрастом, на большой площади
- 20 миллиграммов гиалуроновой кислоты (один шприц объёмом 2,5 миллилитра).
Способы введения Вискодерма
Препарат вводится специальным шприцем с тонкой иглой. В зависимости от цели, которую преследует клиент, выбирается концентрация Вискодерма. Они были разработаны специально для работы на разной глубине.
- Вискодерм 0,8% вводится в верхний слой кожи, эпидермис. Он освежает цвет лица, насыщает кожу влагой, избавляет от первых морщинок.
- Вискодерм 1,6% работает в поверхностном слое дермы и помогает клеткам кожи обновиться, восстановиться.
- Вискодерм 2% вводится очень глубоко, в самую дерму. Он решает наиболее серьёзные проблемы, связанные со старением кожи, утратой упругости.
Противопоказания
Препарат Вискодерм, несмотря на его безопасность, нельзя применять в следующих случаях:
- возраст моложе двадцати пяти лет (в этом случае косметологи советуют мезотерапию);
- беременность и период кормления малыша грудью;
- имеются нарушения свертываемости крови;
- аллергия на анестетики или препараты, в состав которых входит гиалуроновая кислота;
- возникновение келоидных и гипертрофических рубцов;
- онкологические, инфекционные и аутоиммунные болезни, заболевания соединительной ткани.
Проведение процедуры
Первым делом место, куда будет вводиться Вискодерм, смазывается обезболивающей мазью на тридцать минут. Если у пациента высокий болевой порог, то можно обойтись и без анестетика. По истечении срока крем смывается, кожа обрабатывается антисептиком, чтобы исключить возможность заражения.
Техника проведения биоревитализации зависит, в первую очередь, от концентрации Вискодерма, а также от места укалывания. Выделяется три способа введения препарата под кожу:
- Папульная техника используется для неглубокого введения Вискодерма с концентрацией 0,8% и 1,6%.
- Линейная техника предназначена для разглаживания морщин и более серьёзных проблем, связанных с кожей. В этом случае используется Вискодерм 2%.
- Техника «раздавленной капли» используется для биоревитализации кожи вокруг век. Благодаря этому методу отёки, которые особенно заметны в этой области, исчезают гораздо быстрее.
Сколько длится один сеанс биоревитализации?
Это зависит от площади, которую необходимо обколоть инъекциями Вискодерма. В среднем, процедура занимает полчаса, если косметолог работает только с лицом, и около часа, если требуется уколоть также шею, декольте, кисти рук и другие участки кожи. После окончания процедуры места уколов обязательно обрабатываются антисептиком.
Уход за кожей после инъекций Вискодерма
Чтобы не инфицировать места введения уколов, следует придерживаться следующих правил:
- три-четыре дня не ходить в бассейн;
- первые 48 часов лучше вообще не краситься;
- не пользоваться кремами два-три дня;
- не мазать на уколотые части тела лекарственные мази и препараты для удаления синяков.
Чтобы отек после процедуры не усилился:
- четыре дня не занимайтесь спортом;
- не ходите в сауну и не загорайте;
- лишний раз не наклоняйтесь, особенно не работайте в таком положении.
Побочные эффекты после введения Вискодерма
- покраснение кожи в месте укола на два-три дня;
- зуд, жжение и покалывание первые пару дней;
- небольшой отёк, который исчезнет через двое суток;
- синяки и гематомы от четырёх дней до недели;
- фиброз ткани.
Цена процедуры
Стоимость одного сеанса биоревитализации Вискодермом зависит от степени его концентрации.
0,8% – 7-8 тысяч рублей;
1,6% – 8-13 тысяч рублей;
2% – 10-15 тысяч рублей.
Большинство косметологических клиник предлагают скидки при отплате сразу нескольких сеансов. Таким способом можно сэкономить 10-15%.
Фото до и после
Предлагаем вашему вниманию фотографии до и после процедуры биоревитализации Вискодермом. Вы сможете наглядно убедиться, что эффект от неё действительно налицо! Посмотрите, какой кожа была до процедуры, и как она «ожила» и посвежела после. Если вы всё ещё думаете, стоит ли попробовать на себе препарат Вискодерм, надеемся, что фотографии помогут вам принять решение.
Методика приготовления препарата:
· на середину предметного стекла наносят каплю бульонной культуры вульгарного протея. Каплю осторожно покрывают покровным стеклом, не допуская образования между стеклами пузырьков воздуха;
· препарат микроскопируют сухой системой, с использованием объектива х40. Оптика микроскопа должна быть очень чисто протерта, конденсор слегка опущен, а его диафрагма прикрыта с целью затемнения поля зрения.
· протей является перитрихом, передвигается в поле зрения беспорядочно. Важно не спутать характер его движения с пассивным перемещением в результате броуновского движения - беспорядочного колебания клеток.
4. Изучение подвижности протея (Proteus vulgaris) в препарате «висячая капля» с использованием фазово-контрастной микроскопии (демонстрация). Препарат висячей капли готовят, нанося в центр покровного стекла каплю исследуемого материала. Предметное стекло с лункой, края которой смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. После этого препарат переворачивают покровным стеклом вверх; капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. При микроскопии сначала используют объектив «малого» увеличения (х8) для нахождения края капли, после чего определяют подвижность бактерий с помощью объектива «большого» увеличения (х40) или иммерсионной микроскопии.
5. Морфология боррелий – возбудителей возвратного тифа (Borrelia recurrentis). Мазок из крови больного возвратным тифом (демонстрация). Окраска по Романовскому - Гимза. Краситель состоит из смеси азура-2 (продукт окисления метиленового синего) и эозина. Среди эритроцитов заметны тонкие лиловые удлиненные спирохеты, образующие до 9 крупных неравномерных завитков.
6. Морфология возбудителя сифилиса (Treponema pallidum). Окраска по Бурри (тушевой препарат). На темном фоне видны бесцветные трепонемы с 8 - 12 равномерными завитками.
7. Морфология и подвижность лептоспир - Leptospira interrogans. Темнопольная микроскопия (демонстрация). Представители этого рода имеют тонкие частые неглубокие завитки и обладают своеобразным движением, во время которого концы вращаются под углом к основной части тела. В стадии покоя имеют форму крючка. В темнопольном микроскопе используются специальные конденсоры (параболоид-конденсор с затемнением в центре и внутренней зеркальной поверхностью для отражения лучей света, либо кардиоид-конденсор, в котором лучи света отражаются сначала от выпуклой поверхности, а затем от вогнутой). Темнопольные конденсоры создают эффект бокового освещения, в результате чего на темном фоне видны светящиеся микроорганизмы. Морфология спирохет представлена на рис. 20.
8. Морфология риккетсий – возбудителей эпидемического сыпного тифа (Rickettsia provazeki).Окраска по Здродовскому. Методика окраски:
· Окраска мазка фуксином Циля в течение 5 минут.
· Промывание водой.
· Обработка мазка 0,01% раствором хлористоводородной кислоты.
· Промывание водой.
· Окраска метиленовым синим в течение 1 минуты.
· Промывание водой, высушивание, микроскопия. Риккетсии, окрашенные по этому методу, выглядят в виде мелких полиморфных микроорганизмов рубиново-красного цвета.
9. Хламидии (Chlamidia trachomatis) в мазках из уретры больных урогенитальным хламидиозом (внутри - и внеклеточное расположение). Демонстрационный препарат, окраска по Романовскому-Гимза.
10. Актиномицеты в материале от больного актиномикозом (окраска по Романовскому-Гимза). Зарисовать типичные для этого заболевания друзы актиномицетов, отметить лучистую структуру актиномицетов.
Тема 4. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. АСЕПТИКА, АНТИСЕПТИКА, ДЕЗИНФЕКЦИЯ, СТЕРИЛИЗАЦИЯ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДЫ И ЭТАПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Метод раздавленной капли
Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.
Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.
Определение липолитической активности
Липолитические свойства культуры исследуют на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см 3 МПБ добавляют 1 см 3 глицерина и приливают 2см 3 свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (? 5 кап.).
Культуры культивируют в термостате при 37 0 С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.
Приготовление бактериальной суспензии
Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см 3 .
Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.
Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (375)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды.
Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 385С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки.
Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)
Сущность метода заключается в определении в 1 см 3 воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на синтетической питательной среде при температуре 40 С в течении 24 часов. Определение начинают с приготовления разведений. Для этого в несколько пробирок наливают 10 см 3 стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см 3 исследуемой воды. Новой стерильной пипеткой вносят пробу в пробирку со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см 3 из приготовленного разведения и переносят во вторую, из второй в третью и т. д. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. По истечении 24 часов при температуре 40 С подсчитывают число выросших колоний. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. Результаты подсчета выражают в количестве бактерий на 1 см 3 анализируемой воды с учетом посеянного объема.