Бактериальная ферментация. Способ задержки роста бактерий в средах спиртовой ферментации
Воочию убедиться, что Илья Кокотовский готовит неординарные вещи могли те, кто пришел на нашу первую встречу проекта Modern Mondays.
Кроме этого, его меню для Molto Buono- отличный пример того, как можно создавать интересные блюда, не используя ни модных отечественных специалитетов, ни западных деликатесов (которые все равно из-за санкций не купишь)
Мы с удовольствием публикуем его статью о ферментации продуктов и результатах изысканий, еще раз подчеркивая тезис о том, что хороший шеф должен обладать не только практическими знаниями, но и иметь широкую теоретическую базу
Ферментация…
Эта тема настолько обширна, что описать все в одной статье не представляется возможным.
Так что это скорее небольшой доклад, знакомство с возможностями, чем подробное руководство к действию.
Для начала парочка сухих определений. Без них, к сожалению, никак.
Брожение — это процесс анаэробного (проходящего в бескислородной среде) расщепления органических веществ, происходящий под воздействием микроорганизмов или выделенных ферментов.
Ферментация — это биохимическая переработка сырья под воздействием собственных ферментов субстрата.
Оба процесса протекают в бескислородной среде и являются метаболическими процессами.
Есть одно существенное различие — при брожении могут использоваться сторонние культуры и штаммы бактерий. Как правило- дрожжи и ферменты, полученные в результате реакции. Тогда как при ферментации используются естественные дрожжи и другие культуры субстрата, содержащиеся в нем самом.
Таким образом, ферментация- это более узкое понятие.
Чем мы обязаны брожению?
Спиртовое брожение- штамм — дрожжи
процесс- глюкоза расщепляется до этанола и углекислого газа.
продукт- хлеб и его производные, все производные пива,
виноделие.
Молочнокислое брожение- штамм- Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus.
процесс- преобразование лактозы в молочную кислоту
продукт- все производные кисломолочных продуктов.
см. Фото 1
Уксусное брожение- штамм- Acelobacter, около 10 основных разновидностей.
Процесс- распад глюкозы на этанол, углекислый газ.
Окисление этанола до уксусной кислоты.
Продукт- все производные уксусов, симбиотическая культура-
чайный гриб.
Маслянокислое брожение-штамм- Clostridium.
Процесс- результатом деятельности бактерий является
прогоркание жиров
продукт- Бактерии рода Клостридий вырабатывают наиболее сильные из известных ядов - ботулотоксин
один из видов бактерии является возбудителем ботулизма.
см. Фото 2
Продукты ферментации различны, некоторые из них прочно заняли свое место на кухнях мира, став основой для многих рецептов, другие являются опасными токсинами.
Именно поэтому любой продукт, прошедший ферментацию, обязательно подлежит анализу в лабораториях.
Нередко продвинутые рестораны имеют штатного микробиолога для контроля исходного продукта.
Есть и другой путь.
Мы можем менять продукт- его вкус, цвет, аромат, не прибегая к помощи штаммов бактерий.
Ферментативное окисление — это процесс протекающий под влиянием кислорода. По отношению к фруктам — это окисление железосодержащих соединений, а также меланина, образуемого при ферментативном окислении тирозина и пирокатехина.
Мы наблюдаем ферментативное окисление, когда видим потеменение среза яблока, айвы, банана, картофеля и многих других продуктов в большей или меньшей степени.
Для этого необходимо только присутствие кислорода, время и температура.
Вот некоторые из моих изысканий:
Чеснок- ферментативное окисление
см. Фото 3
В процессе чеснок полностью изменил структуру, поменял цвет, аромат на более тонкий, лишенный резких нот. Для ферментации я использовал теплую среду с возможностью доступа воздуха. Присутствие кислорода, это как вы уже поняли основное требование.
Для самого чеснока есть несколько путей ферментации.
1. это долгая ферментация в горячей контролируемой среде. Для этого подходит горячий бокс для хранения сухих продуктов. Температура около 30 г. ц. время — 6 недель. Такой способ длителен и результат не всегда одинаков. Очень важно сохранение влажности вокруг чеснока, поэтому ферментация проходит в индивидуальном боксе с доступов воздуха.
2. ферментация с помощью корейской ферментационной машины. Ее можно заказать по интернету. Но результат стоит того. Время ферментации сокращается до 3-х дней. Температура выше, но на конечном результате это не отражается.
Мини банан- ферментативное окисление.
см. Фото 4
Окисление банана очень вариативно, необходимо только соблюдать заданную температуру. Чем больше времени проходит ферментация, тем боле однородным и сухим он становится. Цвет меняется от терракотового до черного. Меняется аромат к более тонкому.
Этот вид ферментации более безопасен и имеет большой потенциал. Множество экспериментов и новых компонентов, вас ограничивает только ваше собственное терпение, ведь процесс как правило долгий. Кроме того это верный способ добиться пресловутого умами.
С терпением туго, меня всегда так и подмывает увидеть результат, что касается бананов, не редко конца ферментации они вообще не дожидаются,)
Следующий на очереди:
Симбиотическая структура «чайный гриб ». явление просто уникальное. И наверное самый наглядный представитель симбиоза Acelobacter и дрожжей.
Он заслуживает отдельной темы, поэтому до следующего доклада.
Процесс изготовления чая
- это последовательность взаимосвязанных шагов, в самом начале которых - свежесорванный лист, а в самом конце - то, что мы в торговле именуем «законченным» или «готовым» чаем. Шесть видов чая (зеленый, желтый, белый, улун, черный, и пуэр) имеют несколько сходных стадий обработки (такие как сбор, первичная сортировка, окончательная обработка, и т.п.), но имеют и нюансы, которые уникальны для одного или нескольких специфически приготовленных чаев. Окисление
- это один из наиболее поздно описанных химических процессов, который должен протекать при изготовления одних видов чаев, и должен быть предотвращен при изготовлении других. Можно сказать, что все виды чая разделены на два больших класса в зависимости от того, участвует ли окисление в получении готового продукта, или нет.
Окисление в чае
Сначала дадим определение окислению. Окисление - это биохимический, энзимный процесс, во время которого поглощается кислород и (как следствие) происходит изменения веществ, участвующих в процессе. В случае со свежесобранными чайными листьями чая - веществ, содержащихся в чайных листьях. Окисление может быть спонтанным или контролируемым и приводить как к позитивным, так и к негативным изменениям. Хорошо знакомый пример спонтанного негативного окисления - это то, что случается, когда разрезаешь яблоко или банан, или оставляешь на открытом воздухе отрезанный кусочек листка. Незащищенные клетки поглощают кислород, размягчаются, и становятся коричневыми. Это наиболее простая форма окисления, с которой знакомо большинство людей. Если в процесс окисления не вмешиваться, то фрукт может просто высохнуть или сгнить, в зависимости от атмосферных условий. При простом разрезании яблока на кусочки и сушке их в дегидраторе (влагопоглотителе) можно наблюдать пример контролируемого негативного окисления, происходящего в процессе сушки. Потемнение отрезанной поверхности не считается эстетично привлекательным на рынке, так что изменения цвета иногда корректируют сернистыми соединениями или лимонной кислотой, но даже в этой ситуации (без видимых цветовых изменений) окисление все равно протекает.
Во время производства чая присутствует как спонтанное, так и контролируемое окисление. Спонтанное окисление протекает в течении стадии сушки чайного листа при изготовлении белого, улунского и черного чаев. Стадия контролируемого окисления, требующего особого внимания, является одной из наиболее важных этапов производства как улунов, так и черных чаев. В зеленых и желтых чаях окисление предотвращается методами тщательного пропаривания, сушки и/или прожаривания, которое также часто называют «деферментацией» (de-enzyming).
Окисление - это химический процесс, который требует избытка влажного, богатого кислородом воздуха. В производстве черного чая в помещениях для окисления должно производиться от 15 до 20 обменов увлажненного воздуха в течение часа для гарантированного полного окисление. Полифенолы в листе (чайные катехины) поглощают значительное количество кислорода, особенно в течении ранних стадий окисления. Окисление при производстве чая формально начинается с момента сушки чайного листа как спонтанное, и затем постепенно ускоряется последующими шагами, необходимыми для превращения свежего листа в готовый черный чай. После нескольких подготовительных этапов предварительно подготовленный лист готов для процесса контролируемого окисления, о котором часто ошибочно говорят как о «ферментации». В традиционном окислении сортированный лист рассыпают тонкими слоями (максимум от 5 до 8 см) на полу фабрики, на столах, на пористых поддонах - и это сходно с подсушиванием, которое делается на стадии первичного завяливания. Насыщение кислородом полифенолов начинает серию химических реакций с их участием, в конечном итоге производящих новые ароматические компоненты и обеспечивающие более «плотные» отличительные признаки настоя, характерные для черного чая. Во время первого и наиболее важного периода ферментативного окисления, фермент полифенола оксидазы и пероксидазы (группы окислительно-восстановительных ферментов, использующих в качестве акцептора электронов перекись водорода) воздействует на другие полифенолы, в результате этого воздействия появляются теафлавины. Эти красно-оранжевые соединения в дальнейшем воздействуют на полифенолы, производя теарубигины, они же химически ответственны за изменение цвета листа от зеленого к золотому, медному, коричнево-шоколадному. Теарубигины, тем временем, взаимодействуют с несколькими аминокислотами и сахарами в листе, создавая высокополимерные субстанции, которые развиваются в разнообразные и характерные ароматические компоненты, которые мы и рассчитываем иметь в черном чае.
В основном теафлавины привносят свежесть и яркость во вкус черного чая, в то время как теарубигины обуславливают его крепость, насыщенность и цвет.
В процессе окисления из чайного листа выделяется диоксид углерода и происходит повышение температуры массы окисляющихся листьев. Если температуре листа позволить подняться слишком высоко, то окисление выйдет из-под контроля; если температура слишком низко упадет, то окисление прекратится.
Массив чайных листьев в процессе управляемого окисления называется «дхул» (dhool). Окисление требует от 2 до 4 часов и может контролироваться опытным путем, а не научным. Хотя могут быть технические маркеры для определения ожидаемого завершения процесса, но также существует и множество параметров, характеризующих процесс и наблюдаемых «в живую». Поэтому лучшим методом определения момента полного окисления листа может быть экспертное визуально обонятельное наблюдение.
Чайный мастер должен контролировать толщину и равномерность слоя листьев, следить, чтобы температура была примерно 29 С, относительная влажность - 98%; и обеспечивать постоянную вентиляцию (15 или 20 полных смен воздуха в помещении в час). Также микроклимат должен быть полностью гигиеничен; бактерии могут испортить дхул.
При в процессе окисления обрабатываемый лист (дхул) получает прогнозируемую серию вкусовых параметров, свежий, насыщенный цвет и итоговую крепость. Чайный мастер может управлять окислением дхула в своей особенной манере, корректируя длительность окисления, допуская окисление в комбинации с изменением температуры/влажности в помещении для окисления. Большинство произведенных чаев дают сбалансированный настой в чашке с ярким настоем, хорошим интенсивным ароматом, и густой, насыщенной консистенцией. Когда чайный мастер определяет, что дхул окислился до желаемого уровня («полностью окисленный» - это степень, но не абсолютная), то критическая фаза контролируемого окисления останавливается завершающим процессом производства черного чая: сушкой.
Ферментация в чае
Ферментация - это важный компонент в изготовлении пуэров и прочих выдержанных чаев, таких как Люань, Любао, некоторых улунов, и т.д. Рассказ о ферментации в чаепроизводстве удобнее всего вести на примере производства пуэров. Давайте изучим, что такое ферментация и почему тщательная и искусная ферментация неотделима от производства традиционных высококачественных пуэров. Несмотря на то, что производство пуэров - это одна из старейших и простейших форм чаепроизводства, мир пуэров сложен и обширен настолько, что стал предметом пристального внимания чайных экспертов и требует особой тщательности в изучении. В любом случае мы не будем здесь исследовать специфическую комплексность производства пуэров различных типов, так как в этой статье предлагается рассматривать только более основное описание ферментации и окисления.
Ферментация - это микробная активность (деятельность) с вовлечением тех или иных видов бактерий. По определению ферментация происходит наиболее легко в отсутствии кислорода, хотя для старения незрелого шэн-пуэра идеально некоторое воздействие и окружающей среды. Несмотря на то, что обилие кислорода требуется для большинства стадий при изготовлении чая, подверженность к воздействию кислородом в производстве пуэра часто снижается или устраняется после стадии сушения чайного листа. Лист, который трансформируется в пуэр, должен быть подвергнут воздействию бактерий (или располагает бактериями по природе своей) подходящих для прохождения ферментации.
Как и в случае производства «сброженного» яблочного сидра или сыра Рокфор, необходимые для активности микроорганизмов бактерии начинают естественное воспроизводство на открытом воздухе и\или внутри специального помещения для ферментации (сидровый «домик» или камера для созревания сыров). В случае с пуэром бактерии, требующиеся и для инициирования, и для поддержания брожения находятся в следующих местах.
- На поверхности самого листа со старых деревьев в первобытном лесу, где растут крупнолистовые деревья - наиболее известные из них в районе Сишуанбаньны на юго-западе провинции Юньнань в Китае.
- В помещении для производства чая с контролируемым климатом, в которых «сырой (шэн) мао-ча» временно складируется в ожидании прессования; в кучах из «мао-ча» при искусственной ферментации готового (шу) пуэра; или во влажном, насыщенным паром климате, в котором пуэр проходит запрессовку.
- В сухих прохладных помещениях, где блины шэн пуэра хранятся для пост-ферментации и старения под тщательным контролем.
Во время фазы ферментации в производстве пуэра должно сойтись несколько важных факторов. Во время сбора урожая на самом листе, который соответствует нормам, должны иметься «дикие» бактерии - их может быть очень много или очень мало, и от этого тоже будет зависеть качество чая. Лист предназначенный для того, чтобы стать пуэром («маоча», прошедший сушку-завяливание, обжаривание до «убийства зелени» (sa cheen, шацин), сминание (ro nien, жоунянь), и затем частично высушенный лист), складывают в мешки и располагают эти мешки друг на друге в ожидании прессования в насыщенном бактериями пару; или, в случае готового шу пуэра, сваливается в кучи в помещениях, подвергаясь внешнему воздействию. В отличие от невысоких, пористых куч листьев, собранных для окисления, кучи мао-ча, в которых стимулируется искусственная ферментация шу пуэра, заскирдованы плотно, компактно, и с минимальной площадью открытой поверхности. Куча маоча нечасто перемешивается - чтобы дать «отдых» листьям (и не дать ферментации зайти слишком далеко), снабдить бактерии необходимым им кислородом и обеспечить температуру, желательную для благоприятного роста микробов и заданного преобразования листа. В процессе ферментации пуэра кучи часто накрывают - для того, чтобы повысить температуру происходящих в листьях процессов.
Можно представить легкое замешательство в которое приводит чайных торговцев наблюдение за процессами сушки, окисления и ферментации. Наблюдая перемешивание кучи листьев на полу, кучи листьев в траншеях или на настилах, начинающие чаеторговцы могут быть ошарашены тем, что процессы, происходящие при производстве чая, рудиментарны и кустарны (эта кустарность усугубляется нежеланием китайцев объяснять свои «секреты»). И, хотя за последние 75 лет много чего было описано, четко разделить процессы сушки, ферментации и окисления (и, соответственно, четко ими управлять) пока затруднительно.
Крайне важно, чтобы и потребители и чаеторговцы знали характерные различия окисления от ферментации. Эти процессы должны быть понятны и не должны затеряться в выкрутасах чайной терминологии или маркетинга.
Хорошим признаком, отличающим хорошего торговца, является его понимание сути производства белого, улунского и черного чаев, которые очень зависимы от процессов сушки и окисления. Использование терминов «окисление» и «ферментация» недолжным образом способствует путанице у любителей чая. Вдобавок те, кто правильно может идентифицировать, какой тип пуэра предлагается для закупки, и какие условия необходимы для полного завершения незрелого шэн пуэра в его максимальном развитии (продолжительное вызревание, выдержка, и старение), обеспечивают себя надежной закупочной базой. Для чайных энтузиастов, знание - сила, чайный мир становится все более доступным, и знание гарантирует нам все более качественный чай, и много свяких других радостных моментов настоящего удовольствия от выпитого любимого напитка.
(Еще больше информации о производстве чая и разъяснения окислительных процессов в разных типах чаев можно найти в книге The Tea Story; A Cultural History and Drinking Guide by Mary Lou Heiss and Robert J. Heiss, Ten Speed Press October 2007)
| Зеленый чай | Нет окисления * |
| Желтый чай | Нет окисления * |
| Белый чай | Легкое спонтанное окисление (8-15%) |
| Улунский чай | Частичное окисление, контролируемое при производстве (уровень 15-80%) |
| Черный чай | Полное окисление, контролируемое при производстве |
| Пуэр | Полностью ферментированный, не полностью окисленный, существует два основных направления |
| Шэн пуэр | Сырой, исходный, или «зеленый» пуэр - неконтролируемое окисление, хотя минимальное спонтанное окисление может присутствовать |
| Шу пуэр | Готовый, зрелый, или «черный» пуэр - контролируемое окисление как существенное для процесса «ускорения старения» |
* Формулировку «Нет окисления» следует понимать как «Почти нет окисления». Это такое примечание переводчиков.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О КУЛЬТИВИРОВАНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
В общем смысле, ферментация - это биохимическая переработка сырья под воздействием ферментов, содержащихся в нем самом и в сапротрофах (чайного листа, листьев табака), а также вызываемая микроорганизмами. Однако в нашем случае мы рассматриваем исключительно микробную ферментацию (или микробное брожение).
В этой самой старой из всех методик, применяемых в биотехнологии, для производства желаемых продуктов используются живые клетки или молекулярные компоненты их «производственного оборудования». В качестве живых клеток, как правило, используются одноклеточные микроорганизмы, такие как дрожжи или бактерии; из молекулярных компонентов чаще всего находят применение различные ферменты - белки, катализирующие биохимические реакции.
Ферментация - процесс, в котором происходит преобразование исходного сырья в продукт с использованием биохимической деятельности микроорганизмов или изолированных клеток.
Практически синонимами
слова «ферментация» можно считать такие термины, как культивирование, выращивание микроорганизмов, биосинте
з (см. )
Следует отличать микробную ферментацию от биокатализа (в котором уже полученный ранее фермент или биомасса микроорганизмов используются как катализаторы биохимического процесса синтеза продукта из исходного сырья и реагентов) и от биотрансформации (в этом процессе также применяется биокатализатор в виде фермента или биомассы микроорганизмов, но исходное вещество по химической структуре мало отличается от продукта биотрансформации).
Итак, разновидность ферментации - микробное брожение - неосознанно использовалось человеком в течение не одной тысячи лет для производства пива, вина, дрожжевого хлеба и консервированных продуктов - квашеных овощей, соленой (на самом деле - ферментированной) рыбы и т.п. Когда в середине 18 века была открыта роль микроорганизмов в брожении и люди осознали, что именно биохимическим процессам их жизнедеятельности мы обязаны существованием всех этих продуктов, применение методов ферментации значительно расширилось. В настоящее время мы используем довольно широкий спектр возможностей природных микроорганизмов, которые обеспечивают производство необходимых нам продуктов, таких как антибиотики, противозачаточные средства, аминокислоты, витамины, промышленные растворители, красители, пестициды и добавки, необходимые для приготовления пищи.
Микробная ферментация, в комбинации с методом рекомбинантных ДНК, используется для изготовления большого количества продуктов биологического происхождения: человеческого инсулина; вакцины против гепатита В; фермента, используемого для изготовления сыра; разлагаемой микроорганизмами пластмассы; ферментов, входящих в состав стиральных порошков и многого другого. Кроме того, ферментеры используются для выращивания культур самых разных животных и растительных клеток.
Ферментация - это совокупность процессов, результатом которых является культуральная жидкость.
Культуральная жидкость (culture broth) [лат. cultus — возделывание, обрабатывание] - сложная многокомпонентная система, в водной фазе которой содержатся клетки-продуценты, продукты их жизнедеятельности, непотребленные компоненты питательной среды и др. На стадии выделения целевого продукта следует учитывать место его локализации: внеклеточное или внутриклеточное. Иными словами, культуральная жидкость - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток.
РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ НА ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ
При описании процессов ферментации мы не редко упоминаем о "росте" и "размножении" микроорганизмов. Но многие часто путают значения этих слов или ошибочно считают их разными названиями одного и того же процесса. Это не так. Под ростом прокариотной клетки понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, из которых она построена.
Рост бактерий является результатом множества скоординированных биосинтетических процессов, находящихся под строгим регуляторным контролем, и приводит к увеличению массы (а, следовательно, и размеров) клетки. Но рост клетки не беспределен. После достижения определенных (критических) размеров клетка подвергается делению, т.е. размножается.
Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др.
Процесс культивации микроорганизмов - ферментация - начинается с того момента, когда заранее подготовленный посевной материал вводится в реактор. Размножение культуры микроорганизма характеризуется четырьмя временными фазами: лаг-фаза; экспоненциальная; стационарная; вымирание.
Рис.1. Фазы размножения бактериальной клетки на жидкой питательной среде
1)- Лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность - 3-4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК. Во время лаг-фазы метаболизм клеток направлен на то, чтобы синтезировать ферменты для размножения в конкретной среде. Длительность лаг-фазы может быть разной для одной и той же культуры и среды, так как на неё влияет множество факторов. Например, сколько в посевном материале было нерастущих клеток.
2)- Экспоненциальная фаза - это период логарифмического размножения, когда происходит деление клеток с экспоненциальным ростом численности популяции; размножение преобладает над гибелью. Этот период ограничен во времени количеством питательной среды. Питательные вещества кончаются или рост клеток замедляется из-за выделения токсичного метаболита.
Рис. 2. Процесс деления бактериальной клетки
3)- Стационарная фаза. Рост прекращается и наступает так называемая стационарная фаза. Бактерии достигают максимальной концентрации, т.е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит; Метаболизм продолжается и может начаться выделение вторичных метаболитов. Во многих случаях целью является получение не биомассы, а именно вторичных метаболитов, так как они могут использоваться для получения ценных продуктов и препаратов. В этих случаях ферментация целенаправленно удерживается в стационарной фазе.
4)- Фаза отмирания. Если продолжать ферментацию дальше, клетки постепенно будут терять активность, т.е. вымирать. Это фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества.
О СТАДИИ ФЕРМЕНТАЦИИ
Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов). Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация).
Ферментация в жидкой и в твердофазной среде
Культивирование на жидких средах можно разделить на поверхностную и глубинную ферментацию. Поверхностная протекает в кюветах со средой. Кюветы располагают в вентилируемые воздухом камеры. В результате процесса на поверхности среды образуется биомасса в виде пленки или твердого слоя.
Глубинная ферментация происходит во всем объеме жидкой среды. Данный вид ферментации осуществляется как периодическим, так и непрерывным способами.
Твердофазная ферментация , в твердой, сыпучей либо пастообразной среде влажностью от 30 до 80 % осуществляется тремя способами (рис. 3):
- субстрат при поверхностных процессах располагают на подносах тонким слоем (3…7 мм);
- глубинную твердофазную ферментацию проводят в глубоких открытых сосудах, субстрат при этом не перемешивают;
- твердофазная ферментация производится перемешиванием в аэрируемой массе субстрата.
Ферментация (культивирование) может протекать как в аэробных, так и в анаэробных условиях:
Аэробное культивирование применяют в тех случаях, когда в процессе задействованы аэробные микроорганизмы-продуценты. Аэрацию смеси осуществляют подачей воздуха или других газов через газоподводящие трубки, форсунки и т. д.
Анаэробные процессы протекают в герметичных емкостях либо посредством продувания культивируемой среды инертными газами. Конструкция ферментера при анаэробной ферментации проще, чем при аэробной.
Для каждого вида процесса ферментации разработаны различные конструкции ферментеров (рис. 2).
КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ
Рис. 3. Классификация процессов ферментации
По признаку целевого продукта процесса ферментация может быть следующих типов:
- Ферментация, в которой целевым продуктом является сама биомасса микроорганизмов; именно такие процессы часто обозначают словами «культивирование», «выращивание»;
- Целевым продуктом является не сама биомасса, а продукты метаболизма - внеклеточные или внутриклеточные; такие процессы часто называют процессами биосинтеза;
- Задачей ферментации является утилизация определенных компонентов исходной среды; к таким процессам относятся биоокисление, метановое брожение, биокомпостирование и биодеградация.
Исходную среду в процессах ферментации или ее основной компонент часто обозначают словом субстрат .
По основной фазе , в которой протекает процесс ферментации, различаются:
- Поверхностная (преимущ. твердофазная ) ферментация (культивирование на агаровых средах, на зерне, производство сыра и колбас, биокомпостирование и др.);
- Глубинная (преимущ. жидкофазная ) ферментация, где биомасса микроорганизмов суспендирована в жидкой питательной среде, через которую при необходимости продувается воздух или другие газы;
По отношению к кислороду - различают аэробную, анаэробную и факультативно-анаэробную ферментацию по аналогии склассификацией самих микроорганизмов.
По отношению к свету - световая (фототрофная) и темновая (хемотрофная) ферментация.
По степени защищенности от посторонней микрофлоры - асептическая, условно асептическая и неасептическая ферментация. Иногда асептическую ферментацию называют стерильной, что неверно: в среде есть целевые микроорганизмы, но нет чужеродных.
Вусловно асептической ферментации допускается некоторый уровень попадания посторонней микрофлоры, которая способна сосуществовать с основной или по содержанию не превышает определенного предела.
По числу видов микроорганизмов -
различают ферментации на основе монокультуры (или чистой культуры) и смешанное культивирование, в котором осуществляется совместное развитие ассоциации двух или более культур.
ПРОЦЕССЫ ФЕРМЕНТАЦИИ ПО СПОСОБУ ОРГАНИЗАЦИИ
:
- периодические;
- непрерывные;
- объемно-доливные;
- периодические с подпиткой субстрата;
Все эти виды ферментации (по способу их организации) легко идентифицировать но способу загрузки сырья и выгрузки продукта.
В периодических процессах загрузка сырья и посевного материала в аппарат производится единовременно, затем в аппарате в течение определенного времени идет процесс, а после его завершения полученная ферментационная жидкость выгружается из аппарата.
В непрерывных процессах загрузка и выгрузка среды протекают непрерывно и одновременно, причем скорость подачи в аппарат свежей питательной среды равна скорости отбора из аппарата ферментационной жидкости. В итоге объем среды в аппарате сохраняется постоянным в течение длительного времени (рис. 4.2), теоретически - бесконечно, а практически - до какой-нибудь неполадки.
В объемно-доливных процессах
ферментация в промежутках между загрузкой и разгрузкой аппарата протекает как периодическая, но после некоторого времени, определяемого по состоянию процесса, часть ферментативной среды выгружают и заменяю свежей средой.
В периодическом процессе с подпиткой субстрата
часть среды загружается в начале ферментации, а другая часть добавляется Непрерывно по мере протекания процесса (рис. 4.5). Естественным завершением процесса является переполнение аппарата, поэтому необходимо переходить на строго периодический процесс с максимальным объемом среды и быстро завершать его.
БИОРЕАКТОРЫ (ФЕРМЕНТЕРЫ)
Рис. 4. Классификация ферментеров
Для глубинного культивирования бактерий в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы или ферментеры. Ферментер (биореактор) - это прибор, осуществляющий перемешивание культуральной среды в процессе микробиологического синтеза, представляет собой герметический котел, в который заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальную рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ.
Применяется в биотехнологической промышленности при производстве лекарственных и ветеринарных препаратов, вакцин, продуктов пищевой промышленности (ферменты, пищевые добавки, глюкозные сиропы), а также при биоконверсии крахмала и производстве полисахаридов и нефтедеструкторов.
Различают механические, аэрлифтные и газо-вихревые биореакторы, а также аэробные (с подачей воздуха или газовых смесей с кислородом), анаэробные (без подачи кислорода) и комбинированные — аэробно-анаэробные.
ОБЩАЯ СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА
Рис. 5. Схема обычного ферментера
Обычный ферментер представляет собой закрытый цилиндр, в котором механически перемешиваются среда вместе с микроорганизмами. Через него прокачивают воздух, иногда насыщенный кислородом. Температура регулируется с помощью воды или пара, пропускаемых по трубкам теплообменника. Конструкция ферментера должна позволять регулировать условия роста: постоянную температуру, pH (кислотность или щелочность) и концентрацию растворенного в среде кислорода.
1. Подготовка питательной среды
Питательная среда служит источником органического углерода - основного строительного элемента жизни. Микроорганизмы поглощают широкий спектр органических соединений - от метана (СH 4), метанола (СH 3 OH) и углекислоты (СO 2) до природных биополимеров. Кроме углерода клетки нуждаются в азоте, фосфоре и других элементах (K, Mg, Zn, Fe, Cu, Mo, Mn и др.) Важный элемент подготовки питательных сред - стерилизация с целью уничтожения всех посторонних микроорганизмов. Ее проводят термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.
2. Получение чистых штаммов для внесения в ферментер.
Прежде чем начать процесс ферментации, необходимо получить чистую высокопродуктивную культуру. Чистую культуру микроорганизмов хранят в очень небольших объемах и в условиях, обеспечивающих ее жизнеспособность и продуктивность (обычно это достигается хранением при низкой температуре). Необходимо все время поддерживать чистоту культуры, не допуская ее заражения посторонними микроорганизмами.
3. Ферментация - основной этап биотехнологического процесса.
Ферментация - это вся совокупность операций от внесения микробов в подготовленную и нагретую до необходимой температуры среду до завершения биосинтеза целевого продукта или роста клеток . Весь процесс протекает в специальной установке - ферментере.
По окончании ферментации образуется смесь рабочих микроорганизмов, раствора непотребленных питательных компонентов и продуктов биосинтеза. Ее называют культуральной жидкостью или бульоном .
4. Выделение и очистка конечного продукта.
По завершении ферментации продукт, который желали получить, очищают от других составляющих бульона. Для этого используют различные технологические приемы: фильтрацию, сепарирование (осаждение частиц взвеси под действием центробежной силы), химическое осаждение и др.
5. Получение товарных форм продукта.
Последней стадией биотехнологического цикла является получение товарных форм продукта. Они представляют собой либо смесь, либо очищенный продукт (особенно если он предназначен для использования в медицинских целях).
На заметку:
ФАКТЫ О РАЗМНОЖЕНИИ БАКТЕРИЙ
При благоприятных условиях размножение микроорганизмов идет очень быстро. Считают, что бактерия делится пополам через каждые 20-30 мин. По подсчету ботаника Кона, при беспрепятственном размножении в течение 5 суток потомство одной бактерии средней величины (2 мк длины и 1 мк ширины) заняло бы объем, равный объему всех морей и океанов. Но размножение бактерий ограничено рядом факторов и таких фантастических размеров не достигает.
Чрезвычайно малые размеры бактерий и быстрота их размножения имеют огромное значение для понимания условий взаимодействия между микробами и окружающей средой. Объем воды в 0,001 мл способен вместить до 10 9 бактерий. При внесении такого количества бактерий в 1 мл воды в случае равномерного распределения их по всему объему на 1 л воды придется 10 6 бактерий или 1000 бактерий на 1 мл воды. Вот почему, например, ничтожное (!) количество зараженного болезнетворными бактериями вещества достаточно для распространения инфекционных заболеваний, передаваемых через воду.
Ферментация - химические реакции с участием белковых катализаторов - ферментов . Обычно происходят в живой клетке. Часто путают с брожением , но ферментация лишь более простая часть из многих сложных процессов брожения. Например, в результате брожения размножаются дрожжи, а под действием ферментов, вырабатываемых дрожжами, сахар превращается в спирт.
Использование
Исторически наиболее древняя методика использования ферментации - пивоварение. Зерна злаков содержат нерастворимый трудно усваиваемый крахмал. Это делает зерна защищёнными против многих бактерий в течение очень большого срока, но и в то же время крахмал недоступен и самому ростку. Но растущий росток вырабатывает ферменты, превращающие крахмал в легко растворимую и усваиваемую глюкозу. В пивоварении специально проращивают зерна и в оптимальный момент приготовления солода , когда концентрация фермента высокая, росток убивают нагревом. Фермент продолжает превращать крахмал в сахар, который используется для дальнейшего брожения. Таким ферментом является амилаза , превращающая крахмал в мальтозу . Амилаза содержится также в слюне, благодаря чему долго пережёвываемый рис или картофель получает сладковатый привкус.
Другой старинный способ ферментации - сыроделие. Для свёртывания молока используют различные
50. Метаболизм бактерий. Брожение. Виды брожения. Микроорганизмы, вызывающие эти процессы
Метаболизм – совокупность разнообразных ферментативных реакций, происходящих в микробной клетке и направленных на получение энергии и превращение простых химических соединений в более сложные. Метаболизм обеспечивает воспроизводство всего клеточного материала, включая два единых и одновременно противоположных процесса – конструктивный и энергетический обмен.
Метаболизм протекает в три этапа:
1.катаболизм – распад органических веществ на более простые фрагменты;
2.амфиболизм – реакции промежуточного обмена, в результате которых простые вещества превращаются в ряд органических кислот, фосфорных эфиров и пр.;
3.анаболизм – этап синтеза мономеров и полимеров в клетке.
Метаболические пути формировались в процессе эволюции.
Основным свойством бактериального метаболизма является пластичность и высокая интенсивность, обусловленная малыми размерами организмов.
К метаболическим путям у прокариот относятся брожение, фотосинтез и хемосинтез. Наиболее примитивным способом получения энергии, присущим определенным группам прокариот, являются процессы брожения.
Брожение – метаболический процесс, присущий бактериям, характеризующий энергетическую сторону способа существования нескольких групп прокариот, при котором они осуществляют в анаэробных условиях окислительно-восстановительные превращения органических соединений, сопровождающиеся выходом энергии, которую эти организмы используют.
брожение протекает без участия молекулярного кислорода, все окислительно-восстановительные превращения субстрата происходят за счет его «внутренних» возможностей. В результате на окислительных этапах процесса высвобождается часть свободной энергии, заключенной в молекуле субстрата, и происходит ее запасание в молекулах АТФ. Происходит расщепление углеродного скелета молекулы субстрата.
Круг органических соединений, которые могут сбраживаться, довольно широк:
Углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты, пурины, пиримидины.
Может быть подвергнуто сбраживанию, если оно содержит неполностью окисленные (или восстановленные) углеродные атомы
продуктами брожений являются различные органические кислоты (молочная, масляная, уксусная, муравьиная), спирты (этиловый, бутиловый, пропиловый), ацетон, а также СО2 и Н2
образуется несколько продуктов. В зависимости от того, какой основной продукт накапливается в среде, различают молочно-кислое, спиртовое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожений.
В каждом виде брожения можно выделить две стороны: окислительную и восстановительную. Процессы окисления сводятся к отрыву электронов от определенных метаболитов с помощью специфических ферментов (дегидрогеназ) и акцептированию их другими молекулами, образующимися из сбраживаемого субстрата, т. е. в процессе брожения происходит окисление анаэробного типа
Энергетической стороной процессов брожения является их окислительная часть, реакции являются окислительными
Существует несколько исключений из этого правила: некоторые анаэробы часть энергии при сбраживании субстрата получают также в результате его расщепления, катализируемого лиазами.
Примитивность процессов брожения заключается в том, что из субстрата в результате его анаэробного преобразования извлекается лишь незначительная доля той химической энергии, которая в нем содержится. Продукты, образующиеся в процессе брожения, все еще содержат в себе значительное количество энергии, заключавшейся в исходном субстрате.
При дыхательном метаболизме при расщеплении глюкозы выделяется 2870,22 кДж/моль энергии, при брожении на том же субстрате извлекается 196,65 кДж/моль энергии. В процессе гомоферментативного молочнокислого брожения синтезируются 2 молекулы АТФ на 1 молекулу сброженной глюкозы; в процессе дыхания при полном окислении молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ. В обоих случаях эффективность запасания выделяющейся энергии в макроэргических связях АТФ приблизительно одинакова.
При брожении некоторые реакции на пути анаэробного преобразования субстрата связаны с наиболее примитивным типом фосфорилирования – субстратным фосфорилированием, реакции которого локализованы в цитозоле клетки, что указывает на простоту химических механизмов, лежащих в основе этого типа получения энергии.
*Спиртовое брожение. При спиртовом брожении из пировиноградной кислоты в результате ее окислительного декарбоксилирования образуется ацетальдегид, который становится конечным акцептором водорода. В итоге из 1 молекулы гексозы образуются 2 молекулы этилового спирта и 2 молекулы углекислоты. Спиртовое брожение распространено среди прокариотных (различные облигатно- и факультативно-анаэробные бактерии) и эукариотных (дрожжи) форм.
Способность осуществлять в анаэробных условиях спиртовое брожение: Sarcina ventriculi, Erwinia amylouora, Zymomonas mobilis, Основными продуцентами этилового спирта среди эукариот являются дрожжи –аэробы со сформированным аппаратом дыхания, но в анаэробных условиях осуществляют спиртовое брожение по пути субстратного фосфорилирования.
*Молочно-кислое брожение бывает гомоферментативным, при котором в числе продуктов образуется до 90 % молочной кислоты, и гетероферментативным, при котором помимо молочной кислоты значительную долю в продуктах составляют СО2, этанол и/или уксусная кислота.
а)Молочнокислое брожение (гомоферментативное) – это процесс получения энергии молочнокислыми бактериями Lactococcus lactis, Lactobacterium bulgaricum, Lactobacterium planterum и т.д., заключающийся в превращении молекулы сахара в две молекулы молочной кислоты с выделением энергии:C6H12О6 = 2СН3СНОНСООН + 0,075х106 Дж
б)Молочнокислое брожение (гетероферментативное). В этом процессе кроме молочной кислоты в числе продуктов образуются уксусная, янтарная кислоты, этиловый спирт, углекислота и водород. Возбудителем этого процесса является E. coli.
Процесс, подобный нетипичному гетероферментативному молочно-кислому брожению, идет при созревании рыбы пряного посола, пресервов. В этих случаях он возбуждается ароматообразующими молочнокислымим бактериями типа Streptococcus citrovorus.
Кроме того, при порче консервов, возбуждаемой бактериями Вас. stearothermophilus и Cl. thermosaccharolyticum, в продукте накапливаются кислоты – молочная, уксусная, масляная, образование которых, вероятно, связано с процессом, подобному нетипичному молочно-кислому брожению.
*Маслянокислое брожение вызывается облигатно анаэробными маслянокислыми бактериями Cl. pasteurianum. Глюкоза в этом энергодающем процессе превращается в масляную кислоту, водород и углекислый газ:C6H12О6 = С3Н7СООН + 2СО2 + 2Н2 + 0,063х106 Дж
Некоторые клостридии, например, Cl. sporogenes или токсичные виды Cl. botulinum, Cl. perfringens имеют протеолитические способности и не только сбраживают углеводы, но и гидролизуют белки. Возбудители маслянокислого брожения образуют термостойкие споры, поэтому они могут сохраняться в стерилизованных консервах и вызывать их бомбажную порчу.
Известно много других брожений, отдельные типы которых различаются составом конечных продуктов, что зависит от комплекса ферментов возбудителя брожения.
| " |