Реакция непрямой гемагглютинации. Серологические реакции: виды, использование

11621 0

Серологические реакции обозначают в соответствии с феноменами, сопровождающими образование комплекса антиген — антитело при взаимодействии различных по свойствам компонентов. Различают реакции агглютинации, преципитации и лизиса.

Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации (РА) основана на применении корпускулярного антигена (взвесь бактерий, сенсибилизированных эритроцитов, частиц латекса и др.), взаимодействующего со специфическими антителами, в результате чего образующийся комплекс антиген - антитело выпадает в виде осадка. Эту реакцию широко применяют в лабораторной практике для серологической диагностики бактериальных инфекций и для идентификации выделенных микроорганизмов.

РА используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза (реакции Райта, Хеддльсона), туляремии, лептоспироза (РАЛ - реакция агглютинации и лизиса лептоспир), листериоза, сыпного тифа (РАР - реакция агглютинации риккетсий), шигеллеза, иерсиниоза, псевдотуберкулеза и др.

Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РИГА или РПГА).

Для постановки этой реакции используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морских свинок, некоторых птиц), сенсибилизированных антителами или антигеном, что достигается инкубацией взвеси эритроцитов и раствора антигена или иммунной сыворотки.

Диагностикумы, полученные на основе эритроцитов, сенсибилизированных антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами . Они предназначены для определения антител в серийных разведениях сывороток крови, например эритроцитарные шигеллезные диагностикумы, эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы.

Соответственно диагностикумы на основе эритроцитов, сенсибилизированных специфическими иммуноглобулинами, называют антительными (иммуноглобулиновыми) диагностикумами и они служат для выявления антигенов в различном материале, например эритроцитарный иммуноглобулиновый дифтерийный диагностикум для РИГА, применяемый для выявления дифтерийного экзотоксина коринебактерий в жидкой питательной среде при посеве в нее материала из носа и ротоглотки.

Реакцию гемагглютинации применяют для диагностики как бактериальных (брюшной тиф, паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), так и вирусных (грипп, аденовирусные инфекции, корь и др.) инфекций. По чувствительности и специфичности РИГА превосходит РА.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют для титрования противовирусных антител в сыворотках крови, а также с целью установления типовой принадлежности выделенных вирусных культур. РТГА можно применить для диагностики тех вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.

Принцип метода состоит в том, что сыворотка, содержащая антитела к конкретному типу вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность и эритроциты остаются неагглютинированными.

Реакция торможения (задержки) пассивной гемагглютинации (РТПГА).

В РТПГА участвуют три компонента: иммунная сыворотка, антиген (исследуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты.

Если в исследуемом материале есть антиген, специфически реагирующий с антителами иммунной стандартной сыворотки, то он связывает их, и при последующем добавлении эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, гомологичным сыворотке, гемагглютинация не наступает.

РТПГА применяют для обнаружения микробных антигенов, для количественного их определения, а также для контроля специфичности РПГА.

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

В качестве носителя антител (иммуноглобулинов) используют частицы латекса. РЛА является экспресс-методом диагностики инфекционных болезней, учитывая время проведения (до 10 мин) и возможность обнаружить антиген в небольшом объеме исследуемого материала.

РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной жидкости, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода составляет 1-10 нг/мл, или 10³ -10⁶ бактериальных клеток в 1 мкл.

Реакция коагглютинации (РКоА)

Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А стафилококков присоединять специфические иммуноглобулины. РКА - метод экспресс-диагностики - служит для выявления растворимых термостабильных антигенов в секретах человека и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Обнаружение специфических антигенов в составе ЦИК требует их предварительного осаждения из сыворотки крови.

Реакция преципитации

В реакции преципитации (РП) в результате взаимодействия антител с высокодисперсными растворимыми антигенами (белки, полисахариды) образуются комплексы с участием комплемента - преципитаты. Это чувствительный тест, используемый для выявления и характеристики разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной РП является образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку - реакция кольцепреципитации. Широко применяют различные разновидности РП в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез).

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на феномене гемолиза с участием комплемента, т.е. способна выявлять только комплементсвязывающие антитела.

РСК широко применяют для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций, риккетсиозов, хламидиозов, инфекционного мононуклеоза, протозойных инфекций, гельминтозов. РСК является сложной серологической реакцией, в которой участвуют две системы: исследуемая (сыворотка крови), представленная системой антиген - антитело и комплементом, и гемолитическая (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Гемолитическая сыворотка представляет собой инактивированную прогреванием сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Она содержит антитела против эритроцитов барана.

Положительный результат РСК - отсутствие гемолиза - наблюдают в случае, если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену. При этом образовавшийся комплекс антиген - антитело связывает комплемент, а в отсутствии свободного комплемента добавление гемолитической системы не сопровождается гемолизом. В случае отсутствия в сыворотке антител, соответствующих антигену, образования комплекса антиген - антитело не происходит, комплемент остается свободным и сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов, т.е. наличие гемолиза - это отрицательный результат реакции.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

Занятие 14

Тема: Непрямые серологические реакции. Реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), связывания комплемента (РСК).

Антитела

Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенами . Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Строение иммуноглобулинов . Наиболее “типичное” строение имеют IgG. Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями. Участок антитела, который связывается с антигеном, называется активным центром антитела. В молекуле IgG имеется 2 активных центра. Он образован N-концевыми участками тяжелой и легкой цепей. Участок тяжелых цепей, расположенный вблизи дисульфидных связей, называется шарнирной областью. С помощью фермента папаина молекула IgG выше шарнирной области расщепляется на 3 фрагмента: 2 из них содержат легкую цепь и часть тяжелой цепи (Fab-фрагменты); а третий фрагмент состоит только из части тяжелых цепей (Fc-фрагмент). Благодаря подвижной шарнирной области Fab-фрагменты могут изменять взаимное расположение в пространстве.

Аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей делятся на константные (постоянные) и вариабельные участки. Вариабельные участки находятся на N-концах легких и тяжелых цепей (VL и VH). Константные участки находятся на С-концах цепей (СL и СH). В легких и тяжелых цепях аминокислотные последовательности образуют несколько глобулярных структур, которые называются доменами.

Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп ), имеющую определенную конфигурацию и распределение электрических зарядов на своей поверхности. Размер, форма и распределение зарядов в активном центре определяет его специфичность, то есть способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом ), имеющей комплементарную структуру.

Антигенные детерминанты представляют собой участки, выступающие на поверхности молекул антигенов. Поэтому взаимодействие эпитоп-паратоп происходит по принципу “ключ-замок”.

Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой характеризуется понятием аффинность. Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты.

На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных имуноглобулинов. Важным свойством IgG является их способность проходить через плаценту. Таким образом, материнские антитела попадают в организм ребенка и защищают его в первые месяцы жизни от инфекции (естественный пассивный иммунитет).

К классу IgM относится около 10% общего пула иммуноглобулинов. Молекула IgM представляет собой пентамер, то есть состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой IgG, имеет 10 активных центров. Субъединицы соединены между собой дисульфидными связями. В молекуле IgM имеется дополнительная J-цепь, которая связывает субъединицы. Антитела класса IgM не проходят через плацентарный барьер.

Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов. Молекула IgА состоит из 2-х легких и 2-х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра. В сыворотке крови IgА присутствуют в мономерной форме, тогда как в секретах слизистых оболочек IgА представлены в виде димеров и называются секреторными или sIgА, имеют 4 активных центра. С-концы тяжелых цепей в молекуле sIgА соединены между собой J-цепью и белковой молекулой, которая называется секреторный компонент. Секреторный компонент защищает sIgА от расщепления протеолитическими ферментами, которые содержатся в большом количестве в секрете слизистых оболочек. Основная функция sIgА – защита слизистых оболочек от инфекции. IgА не проникают через плацентарный барьер. Высокая концентрация sIgА обнаруживается в женском грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочно-кишечный тракт новорожденного от инфекции.

IgD в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Имеют строение, подобное IgG, 2 активных центра. Биологическая роль до конца не известна.

IgЕ – концентрация этого класса иммуноглобулинов в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. По своему строению IgЕ сходен с IgG, имеет 2 активных центра. Предполагается, что IgЕ имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета. IgЕ играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма , сенная лихорадка) и анафилактического шока.

Реакция непрямой гемагглютинации

В непрямых серологических реакциях комплекс антигенов с антителами не виден невооруженным глазом. В таких случаях антигены адсорбируют на более крупных частицах-носителях (эритроцитах, частицах латекса), получая антигенный эритроцитарный диагностикум. Последующая агглютинация специфическими антителами таких частиц позволяет видеть агглютинат (осадок) невооруженным глазом. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) выявляет антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Эритроциты с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

РНГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Такую реакцию называют РОНГА – реакцией обратной непрямой гемагглютинации.

Компоненты РНГА:

Сыворотка крови больного (разведение 1:25);

Эритроцитарный диагностикум (эритроциты, нагруженные антигеном исследуемого возбудителя);

Промывной раствор.

Постановка РНГА. В семь лунок планшета для иммунологических исследований вносят по две капли фосфатного буферного раствора. В первую лунку прибавляют две капли сыворотки крови больного, после чего из первой лунки переносят 2 капли во вторую лунку, из второй – в третью и т. д. Из шестой лунки 2 капли удаляют. Во все семь лунок (6 опытных и 1 контрольную) прибавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Планшеты оставляют при комнатной температуре на 45 минут, после чего учитывают результаты.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соединении антигена с антителом образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Если комплекс антигена с антителом не образуется, то комплемент остается свободным. Свободный комплемент выявляется добавлением к смеси гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и антител против них. Положительная реакция – отсутствие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом антиген+антитело. Отрицательная реакция – наличие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом эритроцит+антиэритроцитарное антитело.

Компоненты РСК:

Сыворотка крови здорового;

Сыворотка крови больного (в разведении 1:5);

Антигенный компонент реакции - инактивированный возбудитель;

Комплемент в разведении, соответствующем рабочей дозе. Комплемент получают из сыворотки крови морской свинки. Титром комплемента является его минимальная доза, которая в присутствии гемолитической сыворотки вызывает полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза комплемента, используемая при постановке РСК, на 30% больше его титра;

Гемолитическая система - взвесь эритроцитов барана, обработанных кроличьими антителами к эритроцитам барана.

Промывочный раствор.

Постановка РСК. РСК ставят в двух пробирках – опытной и контрольной. В опытную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови больного, в контрольную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови здорового донора, в обе пробирки вносят по 0,5 мл лизата возбудителя, а также по 0,5 мл комплемента. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. После инкубации в обе пробирки вносят по 1,0 мл гемолитической системы. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. При положительной реакции в опытной пробирке отмечается задержка гемолиза (жидкость бесцветная и осадок эритроцитов), в контрольной пробирке – гемолиз эритроцитов.

Литература для подготовки к занятию:

1. Борисов микробиология, вирусология , иммунология. М., 2002.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. . М., 2004.

3. Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

Реакцию проводят для обнаружения антигенов возбудителей в исследуемом материале, добавляя в нему иммунную сыворотку. При наличии гомологичного антигена происходит связывание антител, поэтому после добавления сенсибилизированных антигеном эритроцитов их агглютинации не происходит, что оценивается как положительный результат. Для большей чувствительности реакции специфическую иммунную сыворотку добавляют к исследуемому материалу в минимальном количестве (2 гемагглютинирующие единицы). Титр иммунной сыворотки определяют предварительно с помощью РНГА. За одну гемагглютинирующую единицу принимают предельное разведение сыворотки, которое вызывает склеивание эритроцитов.

Методика. В лунки полистироловых пластин или агглютинационные пробирки вносят по 0,025 мл 1% раствора нормальной сыворотки кролика и делают серийные 2-кратные разведения исследуемого материала. Затем во все лунки добавляют по 0,025 мл имунной сыворотки, пластинку встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 37ºС или на 1 ч при комнатной температуре. Далее во все лунки добавляют по 0,025 мл антигенного диагностикума, встряхивают и оставляют на 2 ч, после чего учитывают результаты.

При проведении этой реакции к контролю для РНГА добавляют контроль специфичности иммунной сыворотки, состоящий из специфического антигена, иммунной сыворотки (2, 1, 0,5 гемагглютинирующей единицы) и взвеси сенсибилизированных эритроцитов.

РТНГА применяют также для обнаружения специфических антител (полных и блокирующих), для чего к исследуемой сыворотке добавляют дозированное количество антигена. Если в ней содержатся антитела, то происходит связывание их антигеном, поэтому после добавления эритроцитов, сенсибилизированных антителами (2-й этап РТНГА), склеивания эритроцитов не происходит.

Благодаря использованию минимального количества антигена (2 нейтрализующие дозы) реакция высокочувствительна. Количество нейтрализующих доз в антигенном препарате определяют с помощью РНГА, при этом делают серийные 2-кратные разведения антигена в 1 % растворе нормальной сыворотки кролика и в лунки вносят антительный эритроцитарный диагностикум. Нейтрализующей дозой антигена считают его максимальное разведение, дающее полное склеивание сенсибилизированных эритроцитов.

Перед проведением реакции испытуемые сыворотки разводят 1:5-1:10 и инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Для адсорбции гемагглютининов к сывороткам добавляют 50 % взвесь формалинизированных или свежих отмытых эритроцитов барана из расчета 0,1 мл взвеси на 1 мл разведенной сыворотки. Смесь встряхивают и инкубируют 30 мин при температуре 37ºС или 1 ч при комнатной температуре, после чего эритроциты осаждают центрифугированием. Можно для осаждения эритроцитов оставить сыворотки в холодильнике до следующего дня.

При проведении опыта исследуемый материал разводят в 1 % растворе нормальной сыворотки кролика в объеме 0,025 мл в лунках панели микротитратора. Затем в каждую лунку добавляют по 2 нейтрализующих дозы антигена в объеме 0,025 мл. Пластины встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 37 °С или на 1 ч при комнатной температуре. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл антительного эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и инкубируют 1,5-2 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результаты реакции. Учет можно производить также и на следующий день. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное разведение ее, в котором не происходит склеивания эритроцитов.

Опыт сопровождают следующими видами контроля:

1) стабильности сенсибилизированных эритроцитов (эритроциты +1 % раствор нормальной сыворотки кролика);

2) полноты истощения гемагглютининов в каждой испытуемой сыворотке (испытуемая сыворотка в наименьшем разведении + формалинизированные эритроциты);

3) правильности определения минимальной нейтрализующей дозы антигена (2, 1 и 0,5 нейтрализующей дозы антигена + антительный эритроцитарный диагностикум).

Реакция обратной непрямой гемагглютинации (ронга) применяется для индикации бактериальных и вирусных антигенов в исследуемых материалах, а также для экспресс-диагностики ряда инфекций.

В отличие от РНГА при данной реакции эритроциты сенсибилизируют не антигеном, а антителами, агглютинация которых происходит при добавлении антигена.

Эритроциты предварительно фиксируют формалином, или глютаральдегидом, а затем связывают их с гамма-глобулином, который выделяют из иммунных сывороток и очищают от других сывороточных белков. Связывание гамма-глобулина с поверхностью эритроцитов происходит с помощью хлорида хрома. Для этого к 8 объемам дистиллированной воды добавляют 1 объем иммуноглобулинов, выделенных из иммунной сыворотки, 1 объем 50 % взвеси формалинизированных эритроцитов и 1 объем 0,1-0,2 % раствора хлорида хрома. Смесь оставляют на 10-15 мин при комнатной температуре, затем обрабатывают эритроциты как при реакции пассивной гемагглютинации.

Специфичность антительного диагностикума проверяют в реакции торможения пассивной гемагглютииации гомологичным антигеном. Реакция должна тормозиться гомологичным антигеном не менее чем в 16 раз и не тормозиться гетерологичным. Используется контроль на отсутствие спонтанной гемагглютинации.

С помощью этой реакции проводят индикацию возбудителей в материале, взятом из органов погибших людей и животных, например, из мозга, селезенки, печени легких. Готовят 10 % суспензию указанных органов на изотоническом растворе натрия хлорида, центрифугируют их в течение 30-60 мин при 10000 об/мин и используют надосадочную жидкость в качестве антигена.

Методика. Готовят 2-кратные разведения исследуемого материала (антигена) на стабилизирующем растворе. Вносят по 1 капле каждого разведения антигена в 3 соседние лунки микропанели (реакция занимает 3 параллельных ряда лунок). В каждую лунку первого ряда добавляют по 1 капле стабилизирующего раствора, в лунки второго ряда – по 1 капле гомологичной иммунной сыворотки в разведении 1: 10, третьего ряда – по 1 капле гетерологичной иммунной сыворотки. Второй и третий ряды служат контролями специфичности реакции. Смесь оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Во все лунки добавляют по 1 капле 1 % суспензии сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарный антительный диагностикум) и тщательно встряхивают пластины. Результаты реакции учитывают через 30-40 мин. При наличии специфического антигена гемагглютинация отмечается в первом и третьем ряду (с гетерологичной сывороткой) и отсутствует во втором ряду, где антиген предварительно нейтрализован гомологичной сывороткой.

Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на спонтанную агглютинацию.

Реакция торможения обратной непрямой гемагглютинации (РТОНГА) позволяет определить наличие антител в сыворотках людей и животных.

Методика. Сыворотки разводят в 10 раз изотоническим раствором натрия хлорида, прогревают 20 мин при температуре 65 °С для разрушения неспецифических ингибиторов, а затем готовят 2-кратные разведения сывороток на стабилизирующем растворе и рабочую дозу антигена, содержащую 4 агглютинирующие единицы. Вносят по 1 капле каждого разведения сыворотки в лунки микропанели и добавляют в них по 1 капле антигена, разведение которого соответствует рабочей дозе. После контакта компонентов смеси в течение 20 мин при комнатной температуре во все лунки вносят по 1 капле эритроцитарного антительного диагностикума и тщательно встряхивают. Через 1,5-2 ч инкубации при комнатной температуре по гемагглютинации учитывают результаты реакции. Титром сыворотки является ее наибольшее разведение, которое полностью тормозит реакцию гемагглютинации с четырьмя агглютинирующими единицами антигена.

Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на спонтанную агглютинацию в присутствии: а) стабилизирующего раствора; б) нормального антигена (из материала, не содержащего вирус); в) исследуемой сыворотки. Преимущество реакции заключается в ее универсальности и возможности использования для выявления различных антигенов.

Оценка результатов гемагглютинации. Результаты РНГА, РОНГА и РТОНГА учитывают по степени агглютинации эритроцитов: (++++) – полная агглютинация; (+++) – менее полная агглютинация; (++) – частичная агглютинация; (+) – следы агглютинации; (–) – отсутствие агглютинации.

Реакция считается положительной, если агглютинация полная (++++) или почти полная (+++), диагностикум не дает спонтанной агглютинации в присутствии каждого компонента реакции и контроль специфичности антигена или антитела положительный.

Оглавление темы "Иммуномодуляторы. Иммунодиагностика инфекционных заболеваний.":

Пассивные реакции агглютинации. Непрямые реакции агглютинации. Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, РПГА). Обратная РНГА. Реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Эти реакции называются непрямыми (пассивными ), так как при их проведении используют Аг (или AT), искусственно сорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА , РПГА ) - одна из наиболее чувствительных серологических реакций. Основана на способности AT взаимодействовать с Аг, фиксированными на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. Для большей стабильности диагностикумов эритроциты формалинизируют.

Обратная РНГА применяется для выявления Аг в сыворотке крови; для этого на эритроцитах фиксируются не Аг, a AT. Реакции этого типа широко применяют для диагностики инфекционных болезней, установления беременности, выявления повышенной чувствительности к лекарствам и т.д.

Реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА ) - дальнейшее развитие РНГА ; в некотором смысле контролирует её специфичность. В отличие от РНГА , включает три компонента; Аг, AT и Аг (AT), адсорбированные на эритроцитах. Первоначально Аг реагирует с AT (стандартная антисыворотка), затем в смесь вносят эритроциты, сенсибилизированные аналогичным Аг (или AT). Если при взаимодействии Аг с AT в системе не остаются свободные AT (или Аг), то агглютинации эритроцитарного диагностикума не наблюдают.